玉米核糖體失活蛋白基因z108在大腸桿菌中的表達及在煙草和番茄的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、為進行抗病毒基因工程及玉米核糖體失活蛋白抗病機制研究，本實驗室從玉米(ZeaMaysL)品種農(nóng)大108胚芽中分離克隆得到了玉米核糖體失活蛋白基因z108，其開放閱讀框為903個堿基對，編碼蛋白301個氨基酸，與Bass(1995)發(fā)表的核苷酸序列的同源性為98.6％，是一個b-32-like基因。本研究將包含開放閱讀框在內(nèi)的玉米核糖體失活蛋白基因片段插入到大腸桿菌表達載體pET30a(+)的多克隆位點中，誘導(dǎo)其在大腸桿菌菌株BL21(D

2、E3)中表達，并由農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana.tobaccum.L)K326和番茄(LycopersiconesculentumMill)品種97-4、櫻紅(Lycopersiconesculentumvar.cerasiforme)，為今后開展抗病機制方面的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。其研究結(jié)果如下：　　1)將包含開放閱讀框在內(nèi)的基因片段插入到大腸桿菌表達載體pET30a(+)的多克隆位點上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(

3、DE3)，37℃培養(yǎng)細菌至對數(shù)生長期以后，26℃誘導(dǎo)表達3h。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明，玉米核糖體失活蛋白基因z108已在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中獲得表達，表達產(chǎn)物為一重組蛋白，分子量大小為52.1KD。這是國內(nèi)首次在原核生物體中表達玉米核糖體失活蛋白基因及其編碼蛋白?！　?)將玉米核糖體失活蛋白基因z108插入到雙元載體pCambia1301的NcoI位點上，以根癌農(nóng)桿菌EHA105為介導(dǎo)進行基因轉(zhuǎn)化，分別在煙草和番

4、茄中表達了該基因，在含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，4個轉(zhuǎn)化菌株pCam91-3-3、pCam92-11-3、pCam91-5-1和pCam92-6-1轉(zhuǎn)化煙草的抗性不定芽分化率達到了57.45-62.79％，而不合有該基因的空載載體pCambia1301在煙草上的轉(zhuǎn)化率75.34％；轉(zhuǎn)化菌株pCam91-3-3在番茄品種櫻紅和97-4上的轉(zhuǎn)化率分別達到了21.57％,22.67％，不含有該基因的空載載體pCambia1301在櫻紅和97-4

5、上的轉(zhuǎn)化率為23.08％，35.82％?！　?)根據(jù)已發(fā)表的基因序列，設(shè)計特異引物，隨機對于煙草轉(zhuǎn)化體91-3-3的5個植株進行PCR擴增，結(jié)果表明，5個轉(zhuǎn)化體中均有插入基因序列的表達，這表明，經(jīng)過潮霉素篩選的轉(zhuǎn)化體植株均含有目標(biāo)基因的插入。　　4)通過組織染色的方法對于表達基因進行Gus基因表達的檢測，可以觀察到，Gus基因可以在煙草轉(zhuǎn)化體91-3-3的葉片的葉肉細胞和根毛細胞的內(nèi)溶物中表達，而pCambia1301的煙草轉(zhuǎn)化體，