苦瓜Ⅰ型核糖體失活蛋白MAP30對膀胱癌抑制作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，目前臨床上治療方法主要有手術治療、化療及放療，這些方法不僅價格昂貴，且易因反復用藥產(chǎn)生耐藥性和毒副作用。祖國醫(yī)學對于膀胱腫瘤的研究起步較晚，但隨著對中草藥研究的進一步深入，中醫(yī)藥在防治膀胱腫瘤方面也有了顯著的進步。中藥治療即可協(xié)同殺傷腫瘤，又有助于機體從整體水平調(diào)節(jié)免疫平衡狀態(tài)，發(fā)揮扶正祛邪的功效?？喙鲜敲耖g喜愛的食物，近年來科研工作者從苦瓜果實和種子中先后提純獲得多種具生物活性的

2、有效成分，具有抗腫瘤、降血糖、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等多種功效，在這些生物活性物質(zhì)中最引人注目的屬核糖體失活蛋白(RIP)。MAP30是Ⅰ型RIP的一種，對多種腫瘤細胞均有抑制作用，但是關于MAP30對人膀胱癌細胞的生長抑制及凋亡影響的相關研究尚未見報道。
　　研究目的：
　　本文通過分子克隆技術表達并純化苦瓜重組MAP30蛋白，并通過咪唑蘭(MTT)法、流式細胞儀檢測分析MAP30對5637人膀胱腫瘤細胞增殖的抑制作用

3、及誘導腫瘤細胞凋亡的作用。
　　研究方法：
　　(1)采用PCR技術從苦瓜基因組中擴增出MAP30基因片段，對其測序并構建重組表達載體pET-28a(+)-MAP30，轉(zhuǎn)化至表達菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導，通過鎳膠柱純化所表達的MAP30蛋白并分析計算其蛋白濃度。
　　(2)將獲得的MAP30蛋白加入處于對數(shù)生長期的人膀胱癌5637細胞共培養(yǎng)，使用咪唑蘭(MTT)法檢測MAP30蛋白對人膀胱癌細胞增殖的抑制作

4、用。
　　(3)將獲得的MAP30蛋白加入處于對數(shù)生長期的人膀胱癌5637細胞共培養(yǎng)，使用流式細胞儀檢測分析MAP30蛋白誘導人膀胱癌細胞的凋亡作用。
　　研究結(jié)果：
　　(1)制備苦瓜基因組DNA并以此為模板，通過PCR技術成功擴增出MAP30基因，與NCBI公布的序列比較同源性100％，;成功構建了pET-28a(+)-MAP30原核表達載體，在BL21(DE3)中實現(xiàn)了可溶性表達獲得重組MAP蛋白，大小約34KD

5、a，與理論值相符。鎳膠柱純化MAP30蛋白，BCA法計算蛋白濃度為434μg/μl，
　　(2) MTT實驗發(fā)現(xiàn)，100μl/mL、200μl/mL及400μl/mL MAP30對5637膀胱癌細胞作用24h或48h后，各實驗組對膀胱癌細胞增殖的抑制作用均明顯高于對照組，各組間比較P＜0.05。
　　(3)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，200μl/mL及400μl/mLMAP30蛋白作用膀胱癌細胞24h或48h后，其膀胱癌細胞凋亡率均

6、高于對照組;MAP30作用48h后細胞凋亡百分率高于24h，400μl/mL劑量的MAP30作用后凋亡率明顯多于200μl/mL。
　　研究結(jié)論：
　　(1)本研究成功構建了pET-28a(+)-MAP30原核表達載體，并獲得重組MAP蛋白。
　　(2) MAP30蛋白可抑制5637人膀胱癌細胞增殖，其效應作用呈劑量、時間依賴性。
　　(3) MAP30蛋白可誘導5637人膀胱癌細胞凋亡，其效應作用呈劑量、時間依