苦瓜Ⅰ型核糖體失活蛋白MAP30對(duì)膀胱癌抑制作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，目前臨床上治療方法主要有手術(shù)治療、化療及放療，這些方法不僅價(jià)格昂貴，且易因反復(fù)用藥產(chǎn)生耐藥性和毒副作用。祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)于膀胱腫瘤的研究起步較晚，但隨著對(duì)中草藥研究的進(jìn)一步深入，中醫(yī)藥在防治膀胱腫瘤方面也有了顯著的進(jìn)步。中藥治療即可協(xié)同殺傷腫瘤，又有助于機(jī)體從整體水平調(diào)節(jié)免疫平衡狀態(tài)，發(fā)揮扶正祛邪的功效?？喙鲜敲耖g喜愛的食物，近年來科研工作者從苦瓜果實(shí)和種子中先后提純獲得多種具生物活性的

2、有效成分，具有抗腫瘤、降血糖、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等多種功效，在這些生物活性物質(zhì)中最引人注目的屬核糖體失活蛋白(RIP)。MAP30是Ⅰ型RIP的一種，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，但是關(guān)于MAP30對(duì)人膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及凋亡影響的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。
　　研究目的：
　　本文通過分子克隆技術(shù)表達(dá)并純化苦瓜重組MAP30蛋白，并通過咪唑蘭(MTT)法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析MAP30對(duì)5637人膀胱腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

3、及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。
　　研究方法：
　　(1)采用PCR技術(shù)從苦瓜基因組中擴(kuò)增出MAP30基因片段，對(duì)其測(cè)序并構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+)-MAP30，轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，通過鎳膠柱純化所表達(dá)的MAP30蛋白并分析計(jì)算其蛋白濃度。
　　(2)將獲得的MAP30蛋白加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膀胱癌5637細(xì)胞共培養(yǎng)，使用咪唑蘭(MTT)法檢測(cè)MAP30蛋白對(duì)人膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制作

4、用。
　　(3)將獲得的MAP30蛋白加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膀胱癌5637細(xì)胞共培養(yǎng)，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析MAP30蛋白誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞的凋亡作用。
　　研究結(jié)果：
　　(1)制備苦瓜基因組DNA并以此為模板，通過PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出MAP30基因，與NCBI公布的序列比較同源性100％，;成功構(gòu)建了pET-28a(+)-MAP30原核表達(dá)載體，在BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)獲得重組MAP蛋白，大小約34KD

5、a，與理論值相符。鎳膠柱純化MAP30蛋白，BCA法計(jì)算蛋白濃度為434μg/μl，
　　(2) MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100μl/mL、200μl/mL及400μl/mL MAP30對(duì)5637膀胱癌細(xì)胞作用24h或48h后，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制作用均明顯高于對(duì)照組，各組間比較P＜0.05。
　　(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，200μl/mL及400μl/mLMAP30蛋白作用膀胱癌細(xì)胞24h或48h后，其膀胱癌細(xì)胞凋亡率均

6、高于對(duì)照組;MAP30作用48h后細(xì)胞凋亡百分率高于24h，400μl/mL劑量的MAP30作用后凋亡率明顯多于200μl/mL。
　　研究結(jié)論：
　　(1)本研究成功構(gòu)建了pET-28a(+)-MAP30原核表達(dá)載體，并獲得重組MAP蛋白。
　　(2) MAP30蛋白可抑制5637人膀胱癌細(xì)胞增殖，其效應(yīng)作用呈劑量、時(shí)間依賴性。
　　(3) MAP30蛋白可誘導(dǎo)5637人膀胱癌細(xì)胞凋亡，其效應(yīng)作用呈劑量、時(shí)間依