銀杏內(nèi)共生真菌的分離及其產(chǎn)黃酮特性的研究.pdf

1、內(nèi)共生真菌(Endophytic fungi)，現(xiàn)在的定義是泛指一些不引起植物組織明顯病害癥狀，生活史中的某一階段在植物的組織內(nèi)生活的微生物，也包括那些對(duì)宿主植物暫時(shí)沒(méi)有傷害的潛伏性病原微生物和菌根菌。當(dāng)研究報(bào)道安德魯紫杉菌（Taxomyces andreanae），一種能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)共生真菌，從短葉紅豆杉的韌皮部中分離得到，這引起了人們研究裸子植物內(nèi)共生真菌抗腫瘤活性的極大興趣。為了解決資源問(wèn)題，近年來(lái)藥用植物內(nèi)生菌成為藥用植物新資

2、源研究的的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　本文以我國(guó)的特有植物—銀杏（Ginkgo bilobaL.）為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)安徽舒城和合肥地區(qū)的銀杏的根、莖、葉組織的內(nèi)共生真菌進(jìn)行分離，實(shí)驗(yàn)采用75％的乙醇對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行表面消毒，多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，銀杏不同組織部位的最佳消毒時(shí)間分別為:銀杏的根為3min，銀杏的莖為2min，銀杏的葉為1min。在此條件下，采用尖端挑取的方法，對(duì)銀杏的根、莖、葉組織中的真菌進(jìn)行分離純化，共得到60株內(nèi)共生真菌，根據(jù)菌落

3、的形態(tài)，顏色進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)分析，排除所得的相同菌落，最終獲得20株銀杏內(nèi)共生真菌。
　　通過(guò)形態(tài)學(xué)進(jìn)行初步鑒定，顯微攝影顯示內(nèi)共生真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中的菌絲大都是透明的，并且是無(wú)隔的，基本屬于單端孢霉屬，鞘孢屬，輪枝孢屬這三大屬。本文通過(guò)結(jié)合顯色法、氯化鋁比色法、薄層層析法對(duì)分離出來(lái)的內(nèi)共生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行初步的定性分析，從而篩選出可以產(chǎn)黃酮的菌株。實(shí)驗(yàn)表明，若發(fā)酵產(chǎn)物中含有黃酮類物質(zhì)，則發(fā)酵產(chǎn)物與氯化鋁反應(yīng)，部分呈現(xiàn)黃綠色熒光。

4、發(fā)酵產(chǎn)物與氫氧化鈉反應(yīng)，部分有黃色出現(xiàn)。發(fā)酵產(chǎn)物與硼酸反應(yīng)，部分出現(xiàn)棕黃色。反之則沒(méi)有此類現(xiàn)象。
　　繼而采用超高壓液相色譜的方法對(duì)產(chǎn)黃酮菌株發(fā)酵進(jìn)行定量分析，從而篩選出具有高產(chǎn)黃酮性能的菌株。實(shí)驗(yàn)表明:經(jīng)過(guò)發(fā)酵復(fù)篩有5株菌株的產(chǎn)黃酮能力超過(guò)5μg/mL。
　　實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)5株高產(chǎn)黃酮的菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了活性鑒定，分別測(cè)定了發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)表明，五種發(fā)酵液均有抑菌活性，

5、且No.2013015菌株的抑菌效果最佳，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選No.2013015為實(shí)驗(yàn)菌株。
　　本文最后從發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件兩方面對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株液體發(fā)酵條件進(jìn)行了探索，得出該系菌株液體發(fā)酵產(chǎn)黃酮的最佳條件。實(shí)驗(yàn)表明，該系菌種最佳產(chǎn)黃酮發(fā)酵培養(yǎng)基條件為:3％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.4％酵母膏、0.3％KH2PO4、0.01％MgSO4·7H2O;最佳培養(yǎng)條件為:起始pH值7.0、最適發(fā)酵溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速為140r/min、裝液量1