HLA-A2-CD35scFv融合蛋白在昆蟲桿狀病毒載體系統(tǒng)中的表達(dá)與純化.pdf

1、人主要組織相容性抗原HLAⅠ類分子廣泛分布于人體內(nèi)各種有核細(xì)胞表面，主要由重鏈(HC)、輕鏈(LC)與抗原肽非共價(jià)結(jié)合而成，可提呈特定的表位供特異性T細(xì)胞識(shí)別。利用HLA Ⅰ類分子與單鏈抗體的融合可將特定的抗原肽/HLA復(fù)合物加載到目的細(xì)胞表面，目前研究主要應(yīng)用于加載HLA分子到腫瘤表面。CD35分子又名補(bǔ)體受體1(CR1)，是一種單鏈膜結(jié)合蛋白，主要分布于紅細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞表面。利用人紅細(xì)胞表面的CD35分子作

2、為靶點(diǎn)，有可能通過HLA分子與CD35單鏈抗體的融合將HLA分子加載到紅細(xì)胞表面，將其作為單一表位的抗原提呈細(xì)胞或者人工靶細(xì)胞。其中CD35單鏈抗體是由免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段鏈接肽連接而成的重組蛋白，具有分子量小，免疫原性低，半衰期短，穿透力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中已經(jīng)成功構(gòu)建HLA-A2/CD35scFv融合基因，但前期的研究結(jié)果顯示原核表達(dá)的HLA-A2/CD35scFv融合蛋白由于其結(jié)構(gòu)

3、的復(fù)雜性，很難在體外正確復(fù)性，直接限制了HLA-A2/CD35scFv融合蛋白的獲得與應(yīng)用。
　　 本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，通過雙表達(dá)載體pFastBacTMDual在草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞sf9中表達(dá)HLA-A2胞外段(α1,α2,α3區(qū)）和CD35單鏈抗體融合基(HLA-A2/CD35scFv)及β2m基因，利用真核細(xì)胞的修飾體系，使HLA-A2/CD35scFv正確折疊，并通過離子交換層析的方法進(jìn)行純化，以獲得具有正確空間

4、構(gòu)象且純度較高的HLA-A2/CD35scFv融合蛋白。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 ㈠pFastBacTMDual+[β2m+HLA-A2/CD35scFv]昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。利用PCR技術(shù)從pET-28a+[HLA-A2/CD35scFv]中擴(kuò)增HLA-A2/CD35scFv融合基因，并通過兩端酶切位點(diǎn)(Sal Ⅰ和HindⅢ)插入pFastBacTMDual啟動(dòng)子PH下游，構(gòu)建形成pFastBacTMDual+

5、[HLA-A2/CD35scFv]質(zhì)粒。同樣的方法從pET-22b+[β2m]質(zhì)粒中以β2-微球蛋白的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物經(jīng)(Sma Ⅰ、Nhe Ⅰ)雙酶切后插入到pFastBacTMDual+[HLA-A2/CD35scFv]質(zhì)粒中，獲得pFastBacTMDual+[β2m+HLA-A2/CD35scFv]質(zhì)粒。經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析，昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　 ㈡重組穿梭質(zhì)粒的獲得與鑒定，重組蛋白的表

6、達(dá)、純化與鑒定將重組質(zhì)粒pFastBacTMDual+[β2m+HLA-A2/CD35scFv]轉(zhuǎn)化E.coil DH10BacTM，PCR鑒定結(jié)果顯示穿梭載體Bacmid含β2m與HLA-A2/CD35scFv目的基因。提取鑒定正確的重組質(zhì)粒Bacanid DNA，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲sf9細(xì)胞，收獲轉(zhuǎn)染后重組病毒用于s19細(xì)胞擴(kuò)增感染。病毒感染后的sf9細(xì)胞分泌重組蛋白到培養(yǎng)上清中，用僅與天然構(gòu)象的HLAI類分子結(jié)合的單克隆抗體W6/

7、32與抗人β2m抗體進(jìn)行雙抗夾心ELISA檢測(cè)，證實(shí)獲得具有正確空間構(gòu)象的HLA-A2/CD35scFv融合蛋白。由pI/Mw批量計(jì)算器[expasy]得知，重組蛋白HLA-A2/CD35scFv的理論等電點(diǎn)(pI)為6.12，BSA的等電點(diǎn)(pI)為4.7，因此選擇陰離子交換層析的方法對(duì)收獲的含融合蛋白上清進(jìn)行純化，利用W6/32與抗人β2m抗體進(jìn)行雙抗夾心ELISA檢測(cè)到純化后的蛋白濃度(14μg/ml)，變性Western blo

8、tting顯示分子量為70kD，與預(yù)期結(jié)果一致。HLA-A2/CD35scFv融合蛋白能夠與紅細(xì)胞表面CD35分子結(jié)合，但結(jié)合率較低，約為4.4％。
　　 本研究顯示，昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)可以有效的表達(dá)出具有空間構(gòu)象的HLA-A2/CD35scFv重組蛋白，通過陰離子交換層析的方法可以使含重組蛋白的培養(yǎng)上清有效純化，且純化后的融合蛋白與紅細(xì)胞具有一定的結(jié)合能力。使HLA-A2/CD35scFv融合蛋白通過CD35分子作為靶點(diǎn)