Fkbp19基因的初步研究及抗體制備.pdf

1、我們利用芯片篩選的方式首先發(fā)現(xiàn)Fkbp19在HBx-p21轉基因小鼠的HCC組織中是高表達的，并用Northern blot的方法進行了驗證；而且在病人HCC組織中檢測Fkbp19的表達發(fā)現(xiàn)，有75％的病例顯示Fkbp19在HCC組織的表達量要高于正常組織。這提示Fkbp19的異常高表達與HCC的發(fā)生發(fā)展有著較高的相關性。
　　 回顧文獻我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)kbp19是一個功能未知基因，目前僅有一篇文獻報道它是FKBP家族的一個成員并具

2、有就較弱的FK506結合能力。通過對Fkbp19的基因和蛋白結構分析我們發(fā)現(xiàn)它有可能定位于內質網(wǎng)及核仁上。Northern blot檢測顯示其在多種外分泌腺中有表達，亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)其可以定位于內質網(wǎng)、核仁及線粒體上。這些結果提示Fkbp19與蛋白的合成分泌密切相關。
　　 接下來我們使用RNAi的技術來敲低Fkbp19的表達并檢測相關細胞表型的變化。我們選擇了Fkbp19表達量最高的乳腺癌細胞系ZR75-1來進行此次干涉實驗

3、，經(jīng)過成功的干涉載體構建，質粒的穩(wěn)定轉染篩選成功得到了穩(wěn)定干涉載體的細胞。兩種不同敲低效率的檢測顯示我們得到了Fkbp19敲低的細胞，可以進行下步實驗。
　　 我們利用MTT的方法來檢測Fkbp19敲低后細胞生長能力的變化，結果發(fā)現(xiàn)細胞生長明顯減慢，而對細胞周期(FCM)檢測結果表明細胞發(fā)生了G1期阻滯，相應的推動細胞經(jīng)過G1/S檢查點的蛋白CDK4及CCND1的表達也顯著下降。Transwell實驗證明細胞在敲低Fkbp19表

4、達后細胞的遷移能力明顯下降。
　　 由于市面上沒有商品化的Fkbp19的抗體，我們就自行制備了Fkbp19的兔源多克隆抗體：經(jīng)過IPTG誘導的原核表達，基于His標簽的蛋白純化，免疫家兔，收集血清，我們的得到的抗血清可以很好的用于Western blot檢測內源以及外源表達的Fkbp19蛋白。
　　 總之，我們發(fā)現(xiàn)Fkbp19的表達在小鼠和人的HCC組織中是升高的，在外分泌腺高表達并與蛋白的合成分泌關系密切。敲低Fkbp