BGT殺蟲基因的原核表達(dá)、抗體制備及在轉(zhuǎn)基因白樺中表達(dá)的初步研究.pdf

1、近年來植物基因工程的研究進(jìn)展十分迅速，人們利用植物基因工程技術(shù)，培育出抗病毒，抗蟲害，抗除草劑及抗鹽，抗旱等抗逆性植物。然而，轉(zhuǎn)基因植物能否長期穩(wěn)定的表現(xiàn)出某一特定的性狀，以及外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)特性等問題，都需要進(jìn)行詳細(xì)的研究。并且，隨著環(huán)境生態(tài)安全問題，日益受到人們的關(guān)注，針對一種外源蛋白，建立一種快速的檢測方法是必要的。
　　針對上述問題，本文以轉(zhuǎn)基因白樺(Betula platyphylla Suk.)中蜘蛛殺蟲肽

2、與Bttoxin C肽融合蛋白(BGT)基因的表達(dá)產(chǎn)物為研究目標(biāo)，采用原核表達(dá)及純化出融合蛋白His-BGT作為抗原，并制備出特異性的抗體。初步建立起快速酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，并對BGT基因在轉(zhuǎn)基因白樺中的表達(dá)特性進(jìn)行了初步的研究。
　　本文的主要研究結(jié)果具體概述如下：
　　1、成功構(gòu)建了BGT殺蟲基因原核表達(dá)載體pET28a-BGT，在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得高效的表達(dá)，并利用金屬螯合親和層析的方法對其進(jìn)行純化，純度可

3、達(dá)90％以上。
　　2、利用純化的融合蛋白His-BGT作為抗原進(jìn)行兔免疫，得到相應(yīng)的抗血清，采用ELISA法檢測效價在1∶10000以上，并對抗血清進(jìn)行了免疫親和層析，獲得了高純度的IgG，Western blot檢測具有較好的特異性。采用過碘酸鈉法將抗體標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)，得到第二抗體即酶標(biāo)抗體，標(biāo)記率在85％以上。
　　3、建立了抗體-抗原-酶標(biāo)抗體的抗體夾心ELISA法，并對方法進(jìn)行了初步的優(yōu)化。確定的抗體

4、的最佳包被濃度為2.0μg/ml，HRP酶標(biāo)抗體最適工作濃度為1∶200。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到了回歸方程y=0.0015x-0.0694，R2=0.99，該方法最低檢測限為40.0 ng/ml。初步建立起檢測BGT殺蟲蛋白的快速、靈敏的方法。
　　4、應(yīng)用建立的檢測方法，檢測了5月份不同轉(zhuǎn)基因白樺中BGT蛋白含量占葉片可溶性總蛋白含量的0.05～0.3％，并利用Western blot驗(yàn)證了方法是可靠的;同時進(jìn)行