EC-SOD基因的克隆和表達研究.pdf

1、本文根據(jù)人類EC-SODcDNA文庫(GenBank登錄號為NM003102)，設(shè)計一對特異性引物，提取人血紅細胞RNA，通過RT-PCR的方法克隆EC-SOD基因的編碼區(qū)片段。該編碼區(qū)長度為465bp，編碼由155個氨基酸組成的，分子質(zhì)量為16KDa的蛋白。 隨后，通過在EC-SOD基因片段兩端添加HindⅢ、BamHlI酶切位點，將其克隆至原核表達質(zhì)粒pQE30，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30-EC-SOD，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，經(jīng)

2、IPTG誘導(dǎo)得到高效表達，并通過Ni-NTASpinKit對表達蛋白進行純化，得到大小約為16KDa的蛋白;EC-SOD原核透析復(fù)性48hr，用焦酚自氧化法對復(fù)性前后的蛋白進行酶活測定，表明復(fù)性后的酶活提高了約1.2倍，效果較好。 此外，在EC-SOD基因片段兩端添加HindⅢ，XbaI酶切位點，將其克隆至真核表達質(zhì)粒pYES2/CT，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYES-EC-SOD，轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303-1a，經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)，通過SDS-P