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文檔簡介
1、糖尿病大血管和微血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死致殘的主要原因,而內(nèi)皮功能損傷是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。棕櫚酸是體內(nèi)含量最多的游離脂肪酸,高濃度棕櫚酸可以損害內(nèi)皮細胞,從而加重動脈粥樣硬化進程。氧化應激是糖尿病及其并發(fā)癥的共同發(fā)病基礎(chǔ),其在高脂誘導的內(nèi)皮細胞損傷中起著至關(guān)重要的作用。胰高血糖素樣肽(GLP-1)是一種腸促胰素,除了降血糖作用外,還可以降低血壓、體重、血脂、降低尿蛋白、改善心功能、延緩動脈粥樣硬化進展、保護血管內(nèi)皮功能,改善糖尿病并發(fā)癥。有
2、研究證實在高糖、同型半胱氨酸、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)等建立的內(nèi)皮細胞氧化應激損傷模型中,GLP-1通過調(diào)節(jié)不同的信號通路發(fā)揮抗氧化應激作用,從而保護內(nèi)皮細胞。有研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可以改善高脂誘導的內(nèi)皮細胞凋亡,目前具體機制尚不明確。
本研究擬通過觀察GLP-1類似物利拉魯肽對棕櫚酸誘導下人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷的影響,并探討其作用機制。
目的:觀察GLP-1類似物利拉魯肽對高脂誘導內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的影響及其機制
3、。
方法:復蘇并培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC),將HUVEC分為正常對照組(NC)、不同濃度棕櫚酸組(PA0.2mmol/L、PA0.4mmol/L、PA0.6mmol/L),分別干預12h、24h、48h,用MTT檢測細胞活力,建立氧化應激損傷模型,然后以不同濃度的利拉魯肽干預氧化應激損傷模型,用MTT檢測細胞活力確定利拉魯肽干預濃度。細胞隨機分為六組:正常對照組(NC)、棕櫚酸組(PA)(0.4mmol/L)、利拉魯肽
4、干預組(L)(100nmol/L)、利拉魯肽+棕櫚酸組(L+PA)、Exendin9-39(200nmol/L)+利拉魯肽+棕櫚酸組(EX)、BAY11-7085(5umol/L)+利拉魯肽+棕櫚酸組(BAY)。利拉魯肽(或Exendin9-39/或BAY11-7085)預處理2小時后,加入棕櫚酸和/或利拉魯肽共同孵育24小時。DHE熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧族(reactiveoxygenspecies,ROS)水平。相應試劑盒測定細胞
5、內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力及丙二醛(MDA)含量。RealTimePCR檢測Bcl-2、Bax、caspase-3、SOD2、CAT、GPX-1的mRNA表達水平,WesternBlot檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、核因子-κBp65(NF-κBp65)、磷酸化核因子-κBp65(p-
6、NF-κBp65)蛋白表達水平。
結(jié)果:
1、MTT檢測結(jié)果
與正常對照組相比,隨著棕櫚酸干預濃度增加和干預時間的延長,HUVEC細胞活力逐漸降低,棕櫚酸0.4mmol/L、0.6mmol/L干預24h、48h細胞活力降低明顯(P<0.05)。棕櫚酸0.4mmol/L與0.6mmol/L干預24h,兩組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與棕櫚酸組相比,加入利拉魯肽(100nmol/L、200nmol/L、40
7、0nmol/L)可以提高細胞活力,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但利拉魯肽三組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),加入利拉魯肽(10nmol/L)與棕櫚酸組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
2、棕櫚酸和利拉魯肽對HUVEC細胞凋亡的影響
與正常對照組相比,棕櫚酸可誘導HUVEC凋亡,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Bax、caspase-3mRNA及蛋白表達增加(P<0.05),Bcl-2mRNA及蛋白表達下降(P
8、>0.05)。
與棕櫚酸組相比,加入利拉魯肽干預后細胞凋亡率下降,有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。Bax、caspase-3mRNA及蛋白表達下降(P<0.05),Bcl-2mRNA及蛋白表達增加(P>0.05)。
3、棕櫚酸和利拉魯肽對HUVEC細胞氧化應激的影響
與正常對照組相比,棕櫚酸組細胞核內(nèi)紅色熒光增強,表示ROS生成增多;加入利拉魯肽干預后細胞ROS生成減少。與正常對照組相比,棕櫚酸組細胞SOD、
9、GSH-PX、CAT活性下降(均P<0.05),SOD2、GPX-1、CATmRNA表達下調(diào)(均P<0.05);加入利拉魯肽干預后SOD、GSH-PX、CAT活性增加,SOD2、GPX-1、CATmRNA表達上調(diào),與棕櫚酸組相比差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與正常對照組相比,棕櫚酸組細胞MDA含量增加(P<0.05),加入利拉魯肽干預后MDA含量下降,與棕櫚酸組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
4、NF-κB、JN
10、K信號通路在氧化應激損傷中的作用
與正常對照組相比,棕櫚酸組p-NF-κB/NF-κB和p-JNK/JNK比值增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與棕櫚酸組相比,利拉魯肽干預可使p-NF-κB/NF-κB和p-JNK/JNK比值降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與利拉魯肽+棕櫚酸組相比,NF-κB抑制劑BAY11-7085干預細胞,p-NF-κB/NF-κB和p-JNK/JNK比值降低(P<0.05);GSH-
11、PX、CAT活性增加(P<0.05),GPX-1、CATmRNA表達上調(diào)(P<0.05);SOD2mRNA表達和SOD活性與利拉魯肽+棕櫚酸組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與利拉魯肽+棕櫚酸組相比,加入GLP-1受體拮抗劑Exendin9-39干預,p-NF-κB/NF-κB和p-JNK/JNK比值增加,SOD、GSH-PX、CAT活性下降,SOD2、GPX-1、CATmRNA表達下調(diào)(均P<0.05)。
結(jié)論:
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