利拉魯肽對(duì)高脂誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病大血管和微血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死致殘的主要原因，而內(nèi)皮功能損傷是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。棕櫚酸是體內(nèi)含量最多的游離脂肪酸，高濃度棕櫚酸可以損害內(nèi)皮細(xì)胞，從而加重動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。氧化應(yīng)激是糖尿病及其并發(fā)癥的共同發(fā)病基礎(chǔ)，其在高脂誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中起著至關(guān)重要的作用。胰高血糖素樣肽（GLP-1）是一種腸促胰素，除了降血糖作用外，還可以降低血壓、體重、血脂、降低尿蛋白、改善心功能、延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展、保護(hù)血管內(nèi)皮功能，改善糖尿病并發(fā)癥。有

2、研究證實(shí)在高糖、同型半胱氨酸、糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）等建立的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中，GLP-1通過(guò)調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可以改善高脂誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，目前具體機(jī)制尚不明確。
　　本研究擬通過(guò)觀察GLP-1類似物利拉魯肽對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　目的：觀察GLP-1類似物利拉魯肽對(duì)高脂誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響及其機(jī)制

3、。
　　方法：復(fù)蘇并培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），將HUVEC分為正常對(duì)照組（NC）、不同濃度棕櫚酸組（PA0.2mmol/L、PA0.4mmol/L、PA0.6mmol/L），分別干預(yù)12h、24h、48h，用MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，建立氧化應(yīng)激損傷模型，然后以不同濃度的利拉魯肽干預(yù)氧化應(yīng)激損傷模型，用MTT檢測(cè)細(xì)胞活力確定利拉魯肽干預(yù)濃度。細(xì)胞隨機(jī)分為六組：正常對(duì)照組（NC）、棕櫚酸組(PA)（0.4mmol/L）、利拉魯肽

4、干預(yù)組（L）（100nmol/L）、利拉魯肽+棕櫚酸組（L+PA）、Exendin9-39（200nmol/L）+利拉魯肽+棕櫚酸組（EX）、BAY11-7085（5umol/L）+利拉魯肽+棕櫚酸組（BAY）。利拉魯肽（或Exendin9-39/或BAY11-7085）預(yù)處理2小時(shí)后，加入棕櫚酸和/或利拉魯肽共同孵育24小時(shí)。DHE熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧族（reactiveoxygenspecies，ROS）水平。相應(yīng)試劑盒測(cè)定細(xì)胞

5、內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）活力及丙二醛（MDA）含量。RealTimePCR檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-3、SOD2、CAT、GPX-1的mRNA表達(dá)水平，WesternBlot檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、核因子-κBp65（NF-κBp65）、磷酸化核因子-κBp65（p-

6、NF-κBp65）蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、MTT檢測(cè)結(jié)果
　　與正常對(duì)照組相比，隨著棕櫚酸干預(yù)濃度增加和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，HUVEC細(xì)胞活力逐漸降低，棕櫚酸0.4mmol/L、0.6mmol/L干預(yù)24h、48h細(xì)胞活力降低明顯（P<0.05）。棕櫚酸0.4mmol/L與0.6mmol/L干預(yù)24h，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與棕櫚酸組相比，加入利拉魯肽（100nmol/L、200nmol/L、40

7、0nmol/L）可以提高細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但利拉魯肽三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），加入利拉魯肽（10nmol/L）與棕櫚酸組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　2、棕櫚酸和利拉魯肽對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡的影響
　　與正常對(duì)照組相比，棕櫚酸可誘導(dǎo)HUVEC凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Bax、caspase-3mRNA及蛋白表達(dá)增加（P<0.05），Bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)下降（P

8、>0.05）。
　　與棕櫚酸組相比，加入利拉魯肽干預(yù)后細(xì)胞凋亡率下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。Bax、caspase-3mRNA及蛋白表達(dá)下降（P<0.05），Bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)增加（P>0.05）。
　　3、棕櫚酸和利拉魯肽對(duì)HUVEC細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　與正常對(duì)照組相比，棕櫚酸組細(xì)胞核內(nèi)紅色熒光增強(qiáng)，表示ROS生成增多；加入利拉魯肽干預(yù)后細(xì)胞ROS生成減少。與正常對(duì)照組相比，棕櫚酸組細(xì)胞SOD、

9、GSH-PX、CAT活性下降（均P<0.05），SOD2、GPX-1、CATmRNA表達(dá)下調(diào)（均P<0.05）；加入利拉魯肽干預(yù)后SOD、GSH-PX、CAT活性增加，SOD2、GPX-1、CATmRNA表達(dá)上調(diào)，與棕櫚酸組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。與正常對(duì)照組相比，棕櫚酸組細(xì)胞MDA含量增加（P<0.05），加入利拉魯肽干預(yù)后MDA含量下降，與棕櫚酸組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4、NF-κB、JN

10、K信號(hào)通路在氧化應(yīng)激損傷中的作用
　　與正常對(duì)照組相比，棕櫚酸組p-NF-κB/NF-κB和p-JNK/JNK比值增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。與棕櫚酸組相比，利拉魯肽干預(yù)可使p-NF-κB/NF-κB和p-JNK/JNK比值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與利拉魯肽+棕櫚酸組相比，NF-κB抑制劑BAY11-7085干預(yù)細(xì)胞，p-NF-κB/NF-κB和p-JNK/JNK比值降低（P<0.05）；GSH-

11、PX、CAT活性增加（P<0.05），GPX-1、CATmRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05）；SOD2mRNA表達(dá)和SOD活性與利拉魯肽+棕櫚酸組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與利拉魯肽+棕櫚酸組相比，加入GLP-1受體拮抗劑Exendin9-39干預(yù)，p-NF-κB/NF-κB和p-JNK/JNK比值增加，SOD、GSH-PX、CAT活性下降，SOD2、GPX-1、CATmRNA表達(dá)下調(diào)（均P<0.05）。
　　結(jié)論：