黃芩莖葉總黃酮對高甘油三酯血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、隨著人們生活水平的提高，生活方式的改變，以及人口老齡化的迅速到來，心腦血管疾病已成為當(dāng)今世界上危害人類生命和健康的最主要的疾病。動脈粥樣硬化(arterio sclerosis，AS)是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，而血管內(nèi)皮細胞損傷是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。近年來，國內(nèi)外研究表明，高甘油三酯(hightriglyceride，HTG)血癥是導(dǎo)致AS發(fā)生的獨立危險因素，它可通過損傷血管內(nèi)皮細胞、促進血管平滑肌細胞增殖、引起脂質(zhì)過氧化、促進血栓

2、形成等啟動AS。在高甘油三酯血癥導(dǎo)致AS的過程中，由于活性氧(reactive oxygen species，ROS)增多引起的氧化應(yīng)激所致的內(nèi)皮細胞損傷可能起到了極其重要的作用。活性氧是調(diào)節(jié)血管功能狀態(tài)的重要信號分子，在生理和病理情況下，體內(nèi)有多種酶參與了ROS的生成。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH oxidase)目

3、前被認為是血管內(nèi)生成ROS的主要酶體，內(nèi)皮細胞主要表達NADPH氧化酶家族(NOX)中的NADPH氧化酶4(NADPH oxidase4，NOX4)。那么，在HTG誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞氧化損傷過程中，是否通過NADPH氧化酶途徑?目前關(guān)于這一研究國內(nèi)外還未見報道，這正是本課題所要研究的內(nèi)容之一，期望從新的角度揭示高甘油三酯血癥致AS的機制并為其防治提供理論依據(jù)。
　　 黃芩莖葉總黃酮(scutellaria baicalensis st

4、em-leaf total flavonoid，SSTF)為黃芩莖葉的提取物，其主要成分為黃酮類化合物。已進行的藥理學(xué)研究表明，SSTF對心腦血管系統(tǒng)具有廣泛的作用，如抗氧化、降血壓、調(diào)血脂、改善心腦血管的供血等。那么，SSTF對HTG誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞氧化損傷是否有保護作用?其保護作用機制是否與抑制NADPH氧化酶表達有關(guān)?這是本課題所要研究的另一內(nèi)容，研究結(jié)果有助于為尋找新的抗AS藥物作用靶點提供實驗依據(jù)。
　　 目的：

5、　　 1.研究人高甘油三酯(HTG)血清對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的氧化損傷效應(yīng)，特別是NADPH氧化酶亞型NOX4在HTG致HUVEC氧化損傷中的作用。
　　 2.觀察黃芩莖葉總黃酮(SSTF)對HTG誘導(dǎo)的HUVEC氧化損傷的保護作用，并從分子水平探討其作用機制。
　　 方法：
　　 1.HTG對HUVEC的氧化損傷效應(yīng)：體外培養(yǎng)HUVEC，分別加入1％、2％、3％、4％、5％的HTG作用于細胞，在8

6、h、12h、16h、20h及24h，通過四唑氮(MTT)比色法測定各組細胞活力(OD值)，黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBA)法測定丙二醛(MDA)含量，流式細胞儀(FCM)檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，觀察HTG對HUVEC的氧化損傷效應(yīng)，并確定最佳的HTG作用濃度和時間。
　　 2.NOX4在HTG致HUVEC氧化損傷中的作用：體外培養(yǎng)HUVEC，加入5％HTG作用于細胞16h，通過

7、RT-PCR法檢測NOX4 mRNA表達，Western blot法檢測NOX4蛋白表達，觀察HTG刺激后HUVEC中NOX4的表達情況。
　　 3.SSTF對HTG致HUVEC氧化損傷的保護作用：終濃度為100mg/L、200mg/L、400mg/L的SSTF以及陽性對照藥物100mg/L的VitC分別與HTG氧化損傷的HUVEC共同孵育16h，通過檢測細胞活力、SOD活性、MDA含量及ROS水平的變化，觀察SSTF的保護作用

8、，并與VitC相比較。
　　 4.SSTF對HTG致HUVEC氧化損傷的保護作用機制：終濃度為100mg/L、200mg/L、400mg/L的SSTF分別與HTG氧化損傷的HUVEC共同孵育16h，通過RT-PCR法檢測NOX4 mRNA表達，Western blot法檢測NOX4蛋白表達，觀察SSTF作用后HUVEC中NOX4的表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.HTG對HUVEC的氧化損傷效應(yīng)：MTT結(jié)果顯示

9、，與Control組相比，4％的HTG作用24h、5％的HTG作用16h以上對HUVEC活力(OD值)有明顯抑制作用(P<0.01)，并呈現(xiàn)時間和濃度依賴關(guān)系；SOD結(jié)果顯示，與Control組相比，2％的HTG作用24h、3％及4％的HTG作用20h以上、5％的HTG作用16h以上可引起HUVEC的SOD活性明顯降低(P<0.01)，并呈現(xiàn)時間和濃度依賴關(guān)系；MDA結(jié)果顯示，與Control組相比，2％的HTG作用20h以上、3％的H

10、TG作用16h以上、4％及5％的HTG作用8h以上可引起HUVEC中MDA含量明顯增加(P<0.01)，并呈現(xiàn)時間和濃度依賴關(guān)系；ROS結(jié)果顯示，未加HTG刺激時，HUVEC內(nèi)可以檢測到一定量的ROS，表明基礎(chǔ)狀態(tài)下細胞內(nèi)也有ROS產(chǎn)生，給予HTG刺激后細胞內(nèi)ROS明顯增加，與Control組相比，1％HTG作用16h以上、2％HTG及以上濃度作用8h以上均可引起細胞內(nèi)ROS明顯增加(P<0.01)，并呈現(xiàn)時間和濃度依賴關(guān)系，尤以5％H

11、TG作用16h增加最為明顯。結(jié)合以上，實驗結(jié)果確定本實驗HTG最佳氧化損傷濃度為5％，最佳作用時間為16h。
　　 2.NOX4在HTG致HUVEC氧化損傷中的作用：RT-PCR結(jié)果顯示，未加HTG刺激的HUVEC內(nèi)有NOX4 mRNA表達，給予HTG刺激后，細胞內(nèi)NOX4mRNA表達明顯增加，與對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Western blot結(jié)果顯示，未加HTG刺激的HUVEC內(nèi)有NOX4蛋白表達，給予HTG

12、刺激后細胞內(nèi)NOX4蛋白表達明顯增加，與對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.SSTF對HTG致HUVEC氧化損傷的保護作用：MTT結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF和100mg/L的VitC都能增加受損細胞活力(OD值)，尤以400mg/L的SSTF和100mg/L的VitC為明顯(P<0.01)；SOD結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF和100mg/L的VitC都能明顯升高氧化損傷細胞的S

13、OD活性(P<0.05或P<0.01)；MDA結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF和100mg/L的VitC都能顯著降低HUVEC的MDA含量(P<0.01)；ROS結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF和100mg/L的VitC都能顯著減少HUVEC內(nèi)ROS的生成(P<0.01)。
　　 4.SSTF對HTG致HUVEC氧化損傷的保護作用機制：RT-PCR結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF都能下調(diào)HTG

14、氧化損傷的HUVEC中NOX4 mRNA表達，除100mg/L的SSTF外，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Western blot結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF均能顯著下調(diào)HTG氧化損傷的HUVEC的NOX4蛋白表達(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.高甘油三酯血清能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞氧化損傷，其氧化損傷的程度與高甘油三酯血清的濃度呈現(xiàn)依賴關(guān)系。
　　 2.高甘油三酯血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞

15、氧化損傷可能通過NADPH氧化酶途徑，NOX4作為內(nèi)皮細胞NADPH氧化酶的主要表達形式，在此氧化損傷過程中可能起一定作用。
　　 3.SSTF對高甘油三酯血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞氧化損傷具有保護作用，能提高內(nèi)皮細胞抗氧化能力、抑制脂質(zhì)過氧化效應(yīng)、減少細胞內(nèi)活性氧生成。
　　 4.SSTF可下調(diào)高甘油三酯血清氧化損傷的血管內(nèi)皮細胞中的氧化酶NOX4的mRNA和蛋白表達，提示SSTF可能通過抑制NADPH氧化酶表達進而減少R