Staphylococcus aureus感染斑馬魚淋巴細胞cDNA文庫的構(gòu)建及其死亡受體基因家族的初步研究.pdf

1、本文通過對斑馬魚兩次腹腔注射金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，成功構(gòu)建了二次感染斑馬魚的淋巴細胞cDNA的表達文庫。對該文庫已測得6988條ESTs序列并拼接成5334clusters，獲得了大量免疫相關(guān)的新基因信息。其間發(fā)現(xiàn)斑馬魚的兩個死亡受體(ORT和HDR)表達量較高，這暗示了它們在二次感染的免疫應(yīng)答中可能起著很重要的作用。 死亡受體(DeathReceptor，DR)在免疫細胞凋亡過程中發(fā)揮重要

2、作用，它們通過結(jié)合特定的配體和依靠胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域(DeathDomain，DD)介導(dǎo)信號從而誘導(dǎo)細胞凋亡。我們PCR分離并克隆得到斑馬魚的五個死亡受體(ORT、DR6、HDR、NGFR和NEW)全長cDNA序列，將它們預(yù)測得到的DD與其它物種死亡受體的DD進行比對，比對后計算出的進化樹將這一個龐大的基因家族按照功能分成了兩大類：一類是跟介導(dǎo)發(fā)育相關(guān)(DR6和NGFR)；另一類是跟免疫反應(yīng)信號通路相關(guān)(ORT、HDR和NEW)。這為下一步

3、深入研究其功能提供了一定的線索。 通過反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)和胚胎整體原位雜交(WISH)等方法對斑馬魚五個死亡受體進行了表達模式的研究分析，得出它們多數(shù)是從胚胎的尾牙期(Budstage)開始表達，HDR和NGFR的表達在胚胎發(fā)育到12個體節(jié)(12-somite)才開始明顯。ORT、NGFR和NEW廣泛表達于各個組織，其中在腎、鰓、腸和腦中表達量相對較高，HDR很特異地表達在成魚腎臟和靠近生殖腺的間質(zhì)細胞團(in

4、termediatecellmass，ICM)中。而DR6主要表達在腎、腦、眼等地方，原雜圖片顯示了其在頭腎中特異而且有高量的表達，由此推測其功能跟T細胞和B細胞的發(fā)育密切相關(guān)。 通過分別構(gòu)建金黃色葡萄球菌和殺鮭氣單孢菌(Aeromonassalmonicida)感染斑馬魚的模型，采用實時定量(QuantitativeRealtimePCR)的方法探究了斑馬魚五個死亡受體對在感染狀態(tài)下免疫應(yīng)答的變化。在金黃色葡萄球菌感染模型中，

5、除了NGFR沒有受影響，其它四個都有相對應(yīng)的上調(diào)：ORT在感染4個小時上調(diào)9.4倍，HDR在24小時上調(diào)9倍，DR6在4小時上調(diào)2.2倍和NEW在24小時上調(diào)7.4倍；然而在殺鮭氣單孢菌感染模型中，NGFR在感染4小時后上調(diào)2.8倍，ORT在15小時上調(diào)了4.2倍，HDR同樣地在24小時上調(diào)了9.8倍，DR6在15小時上調(diào)3.5倍，NEW在4小時上調(diào)3.1倍。 本文還構(gòu)建了斑馬魚五個死亡受體的過表達融合載體pCMV-DR-GFP

6、和其相對應(yīng)的缺失死亡結(jié)構(gòu)域的過表達載體pCMV-DR(D/N)-GFP，通過對老鼠3T3細胞進行轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)這五個死亡受體的確能在非依賴配體的情況下介導(dǎo)了細胞凋亡的信號。而介導(dǎo)凋亡信號的關(guān)鍵部位是死亡結(jié)構(gòu)域，剔除掉DD的過表達載體喪失了凋亡能力，這個跟哺乳類動物的死亡受體一樣。死亡結(jié)構(gòu)域DD的確是在信號傳導(dǎo)方面發(fā)揮著極其重要的作用。 總之，通過對斑馬魚死亡受體基因功能的初步研究可以加深我們對該家族在斑馬魚體內(nèi)所起作用的認識和對斑馬魚