蠕形螨cDNA文庫的構建及初步分析.pdf

1、目的：蠕形螨俗稱毛囊蟲(follicle mite)，它們在分類上屬于真螨目，蠕形螨科(Demodicidae)，永久性寄生于人和哺乳動物的毛囊和皮脂腺內。能寄生于人體的蠕形螨包括兩個種，即毛囊蠕形螨(Demodex folliculorum Simon，1842)和皮脂蠕形螨(Demodex brevis Akbulatova，1963)，分別寄生在人的毛囊和皮脂腺內。人體蠕形螨病是最常見的皮膚病之一，近年隨著人們對美容要求的提高，蠕

2、形螨病的預防和治療問題，受到專業(yè)人士和民眾的關注，但是，目前對蠕形螨的基礎理論研究尚處在低水平，分子生物學研究才剛剛起步。cDNA文庫是研究及鑒定生物的未知功能基因的一種很有效的手段，蠕形螨cDNA文庫的構建為今后利用文庫篩選蠕形螨的未知功能性基因序列及進一步探究該基因的功能等方面的分子生物實驗研究做好鋪墊。山羊蠕形螨cDNA文庫的構建也為人體蠕形螨的cDNA文庫的構建的探索提供方法依據(jù)和技術支持，為進一步探索其分子致病機理打下基礎。<

3、br>　　 方法：采用自然沉降法收集山羊蠕形螨樣本。從濟南市天橋區(qū)桑梓店鎮(zhèn)山羊養(yǎng)殖場獲取新鮮的波爾山羊皮，用手術刀從內側面剖開皮膚結節(jié)，從中取得干酪樣物。在解剖顯微鏡直視下，用自制挑螨針清洗分離蠕形螨個體，將螨挑入另一張滴有清洗液的凹玻片上，反復兩次，在將螨跳入無菌雙蒸中清洗，反復兩次。將洗凈的足量的螨置于自制的消毒微型研缽中，保持低溫下研磨。將蠕形螨勻漿移入EP管中，用TransZol Up試劑盒提取山羊蠕形螨的總RNA，經凝膠電泳

4、檢測總RNA的完整性。參照試劑使用說明書，以RNA為模板，在反轉錄酶的作用下合成第1鏈eDNA，再通過LD-PCR獲得第2鏈cDNA。為提高文庫質量，用凝膠回收法將小于500bp的片段去除來純化雙鏈cDNA。將大于500bp的cDNA片段與pGM-T載體連接，然后將重組質粒轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞構建蠕形螨的cDNA文庫，最后對文庫進行鑒定及分析。
　　 結果：采集到了足量的蠕形螨樣本，成功提取了高質量的山羊蠕形螨總RNA，經檢驗

5、總RNA結構完整且無明顯降解，能滿足構建cDNA文庫的需要。獲得的雙鏈cDNA，經電泳檢測顯示，呈彌散的帶狀，集中在200～3000bp，符合真核生物mRNA分布規(guī)律，表明合成的雙鏈cDNA質量較好，較為完整。去除小于500bp的片段，純化后的cDNA片段與pGM-T載體連接，將重組質粒轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞TOP10建成了蠕形螨cDNA文庫，經鑒定cDNA文庫的重組效率達98％，庫容量為2.56×106cfu，插入片段平均長度大于10

6、00bp，達到構建cDNA文庫的要求。
　　 結論：本次實驗研究成功的提取了蠕形螨的總RNA，并構建了山羊蠕形螨cDNA文庫。cDNA文庫是研究及鑒定生物的未知功能基因的一種很有效的手段，蠕形螨cDNA文庫的構建為今后利用文庫篩選蠕形螨的未知功能性基因序列及進一步探究該基因的功能等方面的分子生物學實驗研究做好了鋪墊。山羊蠕形螨cDNA文庫的構建也為將來人體蠕形螨的cDNA文庫的構建提供了方法依據(jù)和技術支持，為進一步探索人體蠕形螨