大海馬cDNA文庫構(gòu)建、分析及抗菌肽新基因的初步功能研究.pdf

1、摘 要海馬作為一種占 老而名貴的 強(qiáng)壯補(bǔ)益中 藥， 其水溶性藥用活性成分一直未弄清楚。 而作為一 種奇 特和有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的小型 海洋魚類， 海馬的 雄性孵化繁育 模式和免 疫功能一直是尚 未完全解開的 謎。 本論文運(yùn)用分子生物學(xué)、 生物信息學(xué)、 蛋白 質(zhì)化學(xué)和微生物學(xué)等方法， 通過構(gòu)建 c D N A文庫對海馬的藥用、生理及免疫功能進(jìn)行了一些探索性研究， 為保護(hù)、 養(yǎng)殖和開發(fā)利用海馬的深入研究奠定了 基礎(chǔ)。應(yīng)用分子生物學(xué)手段，構(gòu)建了 大海

2、馬全魚的 c D N A 文庫，并對其進(jìn)行了 細(xì)致合理的 分析， 首次 報(bào)道了 與 海馬的 免疫功能以 及 海馬的 藥理活性相關(guān)的 許多 基因， 其 中 包 括 抗 菌 膚 基因h k p l p : 同 時(shí) 本 文 庫的 構(gòu)建 也為 中 藥 海馬的 藥 用 研究 首次提供了 分子表達(dá)譜，為以 后的深入研究奠定了 分子基礎(chǔ)。構(gòu)建了大海馬雄魚孵化袋的 c D N A 文庫，并對其進(jìn)行了合理的分析。這不僅補(bǔ)充了大海馬已 有的 遺傳數(shù)據(jù)，而且

3、首次揭示了 大海馬孵化袋的 分子表達(dá)譜。本研究從孵化相關(guān)的 粘液防御、 營養(yǎng)吸收、 滲透壓調(diào)節(jié)以 及酶和激素調(diào)控等方面為孵化袋的生理功能 研究 提供了 直接的分子證據(jù)， 有助于從生 理和進(jìn)化角度揭示卵 胎生魚類雄性孵化的 奧 秘。 另一 個(gè)抗菌膚基因h k a b f 即 來自 本文 庫。應(yīng) 用 生 物 信 息學(xué) 手 段， 對 假定的 抗菌 膚 基因h k p l p 進(jìn) 行了 序列 分 析， 發(fā) 現(xiàn) 其成熟膚為2 4 膚， 結(jié)構(gòu) 預(yù)測

4、顯 示其屬于 c c - H e l i x 類 抗菌 膚。 通過化學(xué)合成得 到了 足量的 抗菌膚H K P L P . H K P L P 對 1 0 種人和魚 類致病菌 或條件致病菌 株的 活性實(shí)驗(yàn)表明， H K P L P 對大多 數(shù)的G r a m ' 菌和G r a m菌都敏感， 其最小 抑菌 濃度 ( M I C )大 多 不 超 過1 6 1 t g / m l ， 對白 色 念 珠 菌的M I C為3 2 w

5、g / m l ， 對 銅 綠 假單 胞 菌、 副 溶血弧菌和鰻弧菌等三種魚類致病菌的作用較弱。 盡管 H K P L P 對人紅細(xì)胞有一定的 溶血 活性， 但在對大多 數(shù)測 試菌 株有效的 抑菌 濃度下， 溶血 活 性不 超過2 0 Y o 0此外， 還發(fā)現(xiàn)H K P L P 對 H e l a , U 2 5 1 和C 6 等幾 種癌細(xì)胞 有顯著的 細(xì)胞毒 作用，I C s 。 為1 8 - 4 0 1 x g / m l a

6、而 且該 作 用 發(fā) 生 迅 速， 可能 與 海 馬 的 抗 腫 瘤 活 性有 關(guān)。對假定的 抗菌 肚新 基因h k a b f 進(jìn)行了 序列分析， 預(yù) 測其成熟膚 H K A B F為4 7 - 4 9月 太 ， 含 4對二硫鍵， 屬于 p 折疊類抗菌膚。 通過酵母分泌表達(dá)覆蓋法對H K A B F 講行了活性鑒定，表明 其長片段 ( 4 9 膚)和短片段 ( 4 7 膚) 對 G r a m ' 菌Ab s t r a c

7、tA s a f a m o u s a n d e x p e n s i v e s p e c i e s o f t r a d i t i o n a l C h i n e s e m e d i c i n e ( T C M ) , t h ew a t e r - s o l u b l e a c t i v e i n g r e d i e n t s o f s e a h o r

8、 s e r e m a i n e d u n c l e a r . S e a h o r s e i s a s m a l lm a r i n e f i s h w i t h s t r a n g e p r o f i l e a n d c o m m e r c i a l v a l u e a n d i s w e l l k n o w n f o r i t sp

9、a t e r n a l b r o o d i n g . B u t i t s m o l e c u l a r m e c h a n i s m s o f b r o o d i n g a n d i m m u n o l o g y a r es t i l l a n e n i g m a . I n t h i s t h e s i s , t h r o u g h t

10、h e m e t h o d s o f b i o i n f o r m a t i c s , m o l e c u l a rb i o l o g y , p r o t e i n c h e m i s t r y a n d m i c r o b i o l o g y , a s t u d y o n t h e p h a r m a c o l o g i c a l ,p h y

11、 s i o l o g i c a l a n d i m m u n o l o g i c a l f u n c t i o n s o f s e a h o r s e g e n e s w a s c a r r i e d o u t , w h i c hl a y s t h e f o u n d a t i o n f o r t h e f u r t h e r s t u

12、d y o f t h e i r g e n e f u n c t i o n s .A c D N A l i b r a r y o f H i p p o c a m p u s k u d a B l e e k e r w a s c o n s t r u c t e d . A f t e r a d e t a i l e da n a l y s i s , m a n y g e

13、 n e s r e l a t e d t o t h e p h a r m a c o l o g i c a l a n d i m m u n o l o g i c a l f u n c t i o n s o fs e a h o r s e w e r e d i s c o v e r e d , i n c l u d i n g h k p l p g e n e c o d i n

14、g a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e . A t t h es a m e t i m e , t h i s l i b r a r y a l s o p r o v i d e d g e n e e x p r e s s i o n p r of i l e f o r t h e b a s i s o f m e d i c i n eu s

15、a g e o f s e a h o r s e f o r t h e f i r s t t i m e .I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e m o l e c u l a r e x p r e s s i o n p r o f i l e o f b r o o d i n g p o u c h o fs e a h o r s e

16、 , a c D N A l i b r a r y o f b r o o d i n g p o u c h f r o m H . k u d a B l e e k e r w a s a l s oc o n s t r u c t e d . T h e s t u d y n o t o n l y c o m p l e m e n t e d t h e p r e v i o u

17、 s g e n e t i c d a t a a b o u tC h i n e s e s e a h o r s e , b u t a l s o p r o v i d e d d i r e c t m o l e c u l a r e v i d e n c e o n p h y s i o l o g i c a l r o l e so f b r o o d p o u c h

18、 i n c l u d i n g m u c o u s d e f e n s e , n u t r i e n t a b s o r p t i o n , o s m o r e g u l a t i o n a n dr e g u l a t i o n o f e n z y m e s a n d h o r m o n e s , w h i c h c o n t r i b u t

19、e d t o t h e f u r t h e r u n d e r s t a n d i n go f p a t e r n a l b r o o d i n g f r o m e v o l u t i o n a r y v i e w .B y m e a n s o f b i o i n f o r m a t i c s , s e q u e n c e a n a l y s

20、i s o f h k p l p , a p u t a t i v e g e n e c o d i n ga n t i m i c r o b i a l p e p t i d e , w a s i d e n t i f i e d . M a t u r e p e p t i d e o f H K P L P c o n t a i n e d 2 4 a m i n oa c i

21、d r e s i d u e s a n d i t s s e c o n d s t r u c t u r e w a s p r e d i c t e d t o b e a m p h i p a t h i c a - H e l i x . As i g n i f i c a n t a m o u n t o f p r o t e i n w a s o b t a i n e

22、d b y c h e m i c a l s y n t h e s i s . O u r s t u d y i n d i c a t e dt h a t a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t i e s o f 1 4 K P L P w e r e e f e c t i v e o n G r a m p o s i t i v e a n d

23、n e g a t i v eb a c t e r i a l . Mo s t o f MI C s ( m i n i m u m i n h i b i t i o n c o n c e n t r a t i o n ) , l e s sw h i c h w a s l o w e r t h a n i t s c o n c e n t r a t i o n o f m a r k e d