揮發(fā)性全麻藥對氣道傷害性感受器的刺激作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景
　　 吸入全麻藥是一類揮發(fā)性的麻醉氣體，它們的共同特性是抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)活性。與抑制CNS相反，一些全麻藥可以興奮外周傷害性感受器，具有刺激性。目前，從臨床觀察來看，吸入異氟烷和地氟烷時，病人經(jīng)常出現(xiàn)劇烈咳嗽，嚴(yán)重者出現(xiàn)喉痙攣，而七氟烷較少出現(xiàn)呼吸道并發(fā)癥。全麻藥對氣道刺激的作用機(jī)制尚不清楚，但是其臨床特征提示它們可能激活氣道內(nèi)的傷害性感受器。
　　 本課題組

2、前期研究發(fā)現(xiàn)有些吸入全麻藥能提高肺部重要的傷害性感受器--迷走神經(jīng)C纖維的興奮性，促進(jìn)P物質(zhì)的釋放。結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，我們推測揮發(fā)性吸入全麻藥通過激活迷走C纖維和位于肺傳入神經(jīng)末梢的瞬時感受器電位陽離子通道(transient receptor potential cation channels，TRPs)，產(chǎn)生中樞反射和軸突反射，引起咳嗽和喉痙攣等呼吸道癥狀。
　　 目的
　　 1.探討揮發(fā)性全麻藥對支配肺的迷走神經(jīng)

3、C纖維的影響，觀察吸入麻醉下，C纖維對其他化學(xué)刺激的敏感性變化；
　　 2.觀察瞬時感受器電位離子通道(主要是TRPA1和TRPV1)調(diào)節(jié)的離體肺組織傷害性感受器對揮發(fā)性全麻藥的敏感性變化；
　　 3.觀察迷走傳入初級神經(jīng)元上表達(dá)的瞬時感受器電位離子通道(主要是TRPA1和TRPV1)對以異氟烷為代表的刺激性全麻藥的反應(yīng)性；
　　 4.離體和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中揮發(fā)性麻醉藥的給藥途徑比較特殊，需要制備揮發(fā)性全麻藥溶液，探討

4、揮發(fā)性全麻藥溶液如何制備以及離體實(shí)驗(yàn)中麻醉效能的改變。
　　 方法
　　 1.采用在體記錄迷走神經(jīng)單纖維的方法，觀察肺C-fiber對不同濃度(0.5MAC、1MAC、2MAC)異氟烷和七氟烷的反應(yīng)。確定異氟烷可以激活C-fiber后，在給予異氟烷通氣的狀態(tài)下，觀察C-fiber對給予辣椒素刺激的敏感性有無變化；
　　 2.采用離體肺組織記錄迷走神經(jīng)單纖維的方法，選擇只對化學(xué)刺激有反應(yīng)的感受野，給予相當(dāng)于等效臨床

5、濃度(0.5MAC、1MAC、2MAC)的異氟烷、地氟烷和七氟烷的Krebs溶液，觀察支配這些感受野的C-fiber放電活動。為進(jìn)一步確定TRPA1在氣道感受器對全麻藥的敏感性中的作用，觀察TRPA1拮抗劑HC-030031對異氟烷和地氟烷引起的反應(yīng)是否有阻斷作用；為進(jìn)一步確定TRPV1在氣道感受器對全麻藥敏感性中的作用，采用TRPV1基因敲除小鼠，觀察離體肺C-fiber對不同濃度異氟烷和地氟烷溶液的反應(yīng)；
　　 3.用熒光指

6、示劑逆行標(biāo)記小鼠結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中支配肺的神經(jīng)元，7-10天后急性分離培養(yǎng)迷走初級傳入神經(jīng)元，用鈣成像的方法觀察支配肺的迷走初級神經(jīng)元上的TRPV1和TRPA1通道對異氟烷的反應(yīng)；給予TRPA1拮抗劑HC-030031灌流，觀察異氟烷對細(xì)胞內(nèi)的鈣信號強(qiáng)度有無改變；給予異氟烷灌流的情況下再給予辣椒素，觀察細(xì)胞內(nèi)的鈣信號是否增強(qiáng)；
　　 4.配制吸入全麻藥的Krebs溶液至過飽和，用氣相色譜/質(zhì)譜分析法檢測三種麻醉藥飽和溶液的濃度，檢測可

7、用于離體和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的稀釋若干倍數(shù)的溶液濃度；為了觀察揮發(fā)性，將同樣濃度的稀釋溶液敞口靜置15min后檢測溶液濃度；檢測灌流槽內(nèi)的麻醉藥溶液濃度，評估麻醉藥在實(shí)驗(yàn)過程中的損失。
　　 結(jié)果
　　 1.一共在23只大鼠頸部迷走神經(jīng)上記錄到30根C-fiber，其中異氟烷(isoflurane)組18根，七氟烷(sevoflurane)組12根。靜息狀態(tài)下C-fiber的基礎(chǔ)放電頻率為0.55±0.07impulse/s，這些

8、C-fiber對capsaicin的激活時間為1.62±0.14s，C-fiber被激活后的放電頻率為4.55±0.51impulse/s。
　　 吸入0.5MAC異氟烷后，C-fiber的放電頻率(0.95±0.1impulse/s)沒有明顯增加(p>0.1)，吸入1MAC異氟烷后，C-fiber的放電頻率(2.2±0.25impulse/s)明顯高于靜息狀態(tài)下的基礎(chǔ)放電(p<0.01)，當(dāng)吸入濃度增加到2MAC時，C-fib

9、er的放電頻率進(jìn)一步增加(4.18±0.31impulse/s)，高于基礎(chǔ)放電(p<0.01)，也高于0.5MAC和1MAC組(p<0.01)。
　　 吸入三種濃度的七氟烷均不能引起C-fiber放電頻率的增加(p>0.1)。1MAC和2MAC異氟烷對C-fiber的刺激作用也顯著高于同等濃度的七氟烷(p<0.01)。
　　 雖然異氟烷可以激活C-fiber，但是放電頻率低于capsaicin(p<0.01)，在吸入is

10、oflurane的狀態(tài)下，經(jīng)頸內(nèi)靜脈給予同等劑量的capsaicin，C-fiber放電頻率明顯高于純氧通氣時靜脈注射capsaicin的反應(yīng)(p<0.01)。
　　 2.在小鼠離體肺組織上一共得到124/226(54.9％)個纖維是可以納入觀察的C-fibers。向感受野注射三種濃度的isoflurane和desflurane后，纖維放電均高于基礎(chǔ)放電(p<0.01)，2MAC的isoflurane和desflurane引起的

11、纖維放電高于0.5MAC(p<0.05)，sevoflurane組與基礎(chǔ)放電相比沒有明顯變化(p>0.05)。
　　 相同MAC濃度下，isoflurane和desflurane組高于sevoflurane組(p<0.01)，isoflurane和desflurane組間無差別(p>0.05)。用30μMHC-030031灌流10min后，向感受野注射isoflurane和desflurane溶液，發(fā)現(xiàn)isoflurane和de

12、sflurane對氣道感受器的刺激作用被明顯抑制。
　　 TRPV1基因敲除(knockout，KO)小鼠的肺中分離出30根C-fiber。用相當(dāng)于1MAC、2MAC的isoflurane和desflurane溶液注射入感受野，發(fā)現(xiàn)C-fibers仍可以被激活，但是放電頻率較野生型小鼠減弱，兩個濃度的isoflurane對KO小鼠的氣道刺激均小于野生型小鼠(p<0.05)，給予30μMHC-030031灌流后isoflurane

13、和desflurane引起的纖維放電均被抑制(p<0.01)。
　　 3.急性分離的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)(nodose ganglia，NG)經(jīng)酶解消化后獲得單個神經(jīng)元，支配肺的迷走初級傳入神經(jīng)元占20％～30％。2MAC isoflurane和0.3 mM CA都可以使胞內(nèi)鈣濃度增加；TRPA1阻斷劑HC-030031能抑制isoflurane對nodose神經(jīng)元的興奮作用。
　　 2MAC isoflurane可以增強(qiáng)caps

14、aicin對TRPV1的激活作用，胞內(nèi)鈣濃度明顯增高；以第一次給capsaicin的相對熒光強(qiáng)度△F/F0作為標(biāo)準(zhǔn)，isoflurane+capsaicin能明顯增加胞內(nèi)鈣濃度(p<0.01)。
　　 4.用氣相色譜/質(zhì)譜分析法測得三種麻藥飽和溶液濃度(mM)分別為：Isoflurane 15.7±0.5：Desflurane 20.2±0.8：Sevoflurane 6.0±0.3。靜置15min后母液濃度并沒有明顯下降，地氟

15、烷和異氟烷母液濃度甚至還略有上升，但與密閉組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。
　　 從稀釋溶液中取的樣本測得的數(shù)值總是小于計(jì)算值，這部分代表了麻藥準(zhǔn)備期的損失，占到2-13％。在灌流過程中浴槽內(nèi)的麻藥濃度迅速上升并達(dá)到恒定值，浴槽內(nèi)的濃度始終低于計(jì)算值，這部分代表了麻藥在灌流過程中的損失，占到10-40％。從實(shí)驗(yàn)開始稀釋母液到最后灌流完成，整個過程中麻醉藥的損失是10-50％。
　　 整個灌流過程中，濃度高的溶液麻醉

16、藥損失程度高于濃度低的溶液。
　　 討論
　　 1.刺激性全麻藥可以激活迷走神經(jīng)C-fiber，產(chǎn)生咳嗽、氣促、分泌物增多、喉痙攣等呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥；隨著濃度升高激活作用越明顯，而且異氟烷可以增加C-fibers對capsaicin這類化學(xué)刺激的敏感性。
　　 2.導(dǎo)致C-fiber興奮性增高的原因可能與刺激性全麻藥直接激活表達(dá)于結(jié)狀神經(jīng)節(jié)和分布于肺組織迷走神經(jīng)末梢上的TRPA1通道有關(guān)；TRPA1的特異性拮抗劑H

17、C-030031可以完全阻斷刺激性全麻藥對TRPA1的興奮作用。
　　 3.刺激性全麻藥雖然不能直接激活TRPV1，但是可以增強(qiáng)TPRV1通道對化學(xué)刺激的敏感性。在沒有TRPV1的情況下，C-fiber對化學(xué)刺激的敏感性下降。本研究揭示了TRPA1是刺激性全麻藥產(chǎn)生呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥的主要作用靶點(diǎn)，而TRPV1起到了非常重要的協(xié)同作用，兩者在氣道內(nèi)的共存是機(jī)體對外界刺激做出防御反應(yīng)的重要因素。七氟烷不能激活TRPA1和TRPV1，更