異常核型人類胚胎干細胞向腫瘤演進的初步研究.pdf

1、第一章異常核型人類胚胎干細胞的鑒定及細胞遺傳學的分析。 目的：檢測異常核型人類胚胎干細胞的生物學及細胞遺傳學特性并探索隨著傳代的進行，染色體發(fā)生改變的規(guī)律。 方法：對人類胚胎干細胞，在體外培養(yǎng)的過程中，每5-10代進行染色體的分析，通過 G 顯代、比較基因組雜交及原位雜交技術檢測并確定細胞核型。對實驗采用異常核型人類胚胎干細胞株chHES<,3>進行三個方面的檢測，胚胎干細胞的未分化特性，如胚胎干細胞表面標記，堿性磷酸酶

2、(AKP)活性：體內外分化能力檢測，如擬胚體形成能力，胚層相關基因表達，體內畸胎瘤形成等。 結果：異常核型的人類胚胎干細胞染色體檢測發(fā)現(xiàn)：在早期的變異中(P34)，表現(xiàn)為單一的核型，核型為46,XX,dup(1)(p32pter)；傳代到P44-P99時，核型日益復雜無序，出現(xiàn)累及多條染色體的結構重排和復雜的重排，代基礎上X三體重新變成X二體。異常人類胚胎干細胞(chHESC3)生物學特性均符合國際胚胎干細胞建系標準，細胞表達S

3、SEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct4 等胚胎干細胞的特異性標記，AKP染色呈陽性;掃描電子顯微鏡觀察，相對正常核型的HES細胞，異常核型的HES細胞質內擁有更發(fā)達的細胞器結構;chHESC3 脫離飼養(yǎng)層細胞后在含有血清替代物的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)能夠形成擬胚體，對擬胚體進行檢測發(fā)現(xiàn)：擬胚體表達內、中、外胚層的標志基因如 AFP、tansferrin、KDR、nestin、SOXl 等，而全能性相關基因nanog

4、、oct4表達明顯下調;異常核型的人類胚胎干細胞注射到SCID鼠大腿體內形成畸胎瘤，包含有來源于三個胚層的細胞。 結論：正常與異常核型chHESCs-3細胞株仍保持未分化狀，具有多能性;異常核型的人類胚胎干細胞具有正常人類胚胎干細胞的特征，也是一種胚胎性細胞;核型的改變符合腫瘤染色體變化的規(guī)律。 第二章異常核型的人類胚胎干細胞表型特征。 目的：研究異常核型的人類胚胎干細胞細胞細胞生物學表型特征。 方法：采

5、用在亞優(yōu)化培養(yǎng)條件下，觀察正常核型、異常核型的人類胚胎干細胞體外培養(yǎng)狀況；檢測正常核型、異常核型人類胚胎干細胞細胞周期的分布；檢測正常、異常核型人類胚胎干細胞細胞凋亡率；檢測體外形成單克隆能力；檢測正常核型、異常核型胚胎干細胞細胞群落中不同亞群分布；生物信息學分析單純一號染色體重復區(qū)域與細胞增殖、細胞周期調控、腫瘤演進相關基因并進行檢測。 結果:在亞優(yōu)化培養(yǎng)條件下，正常核型的人類胚胎干細胞分化嚴重，具有很高的分化比例，但是異常核

6、型的人類胚胎干細胞細胞在克隆的邊緣或中央較容易保持未分化狀態(tài)；正常核型的人類胚胎干細胞細胞周期中 S 期細胞的比例為 34.12±0.8054％；在復雜核型異常組早期(P70-110)S期細胞所占的百分比為35．08±3．96％，G1期細胞則是52．16±8．38％。在復雜核型組晚期(P120-180)，S期細胞所占的百分比是47．6±7．54％，而G1期細胞比例下降至37．2±3．09％，隨著傳代次數(shù)的增加，S期細胞在細胞周期中所占的

7、比例變得越來越高。 結論：異常核型的人類胚胎干細胞具有更強的保持未分化能力、具有更強的自我更新的能力、更強的抗凋亡能力；正常核型的HES細胞與異常核型的HES細胞群落中存在著明顯的異質性，處在原始干細胞不同發(fā)育的階段。 第三章異常核型的人類胚胎干細胞向腫瘤演進的表型。 目的：比較正常核型、復雜核型人類胚胎干細胞和EC細胞致瘤的差別，評估異常核型的人類胚胎干細胞體內致瘤能力。 方法：通過畸胎瘤實驗模擬異常核

8、型的人類胚胎干細胞向腫瘤演進的過程。將異常核型的人類胚胎干細胞分為三組：1)核型正常組；2)核型變異組(復雜核型)；3)畸胎癌干細胞組；取生長狀態(tài)較好的人類胚胎干細胞注射入嚴重免疫缺陷小鼠后退肌肉內，觀察腫瘤大小，監(jiān)測小鼠的體重隨時間的關系，10周后處死SCID鼠，制備組織切片，HE染色后光鏡下觀察細胞的組織形態(tài)，原始神經(jīng)管樣結構，并與臨床的畸胎瘤標本進行比較；不同發(fā)育時間正常核型人類胚胎干細胞致畸胎瘤標本的比較；免疫組織化學法檢測畸胎

9、瘤中各分子的表達情況。 結果：異常核型的人類胚胎干細胞形成的瘤組織內可見數(shù)量不等的三個胚層衍化的組織：分化程度為未成熟、欠成熟和完全成熟的瘤組織，各胚層瘤組織成份互相摻雜，可見分化成熟的骨、軟骨組織、鱗狀上皮、腺上皮、肝臟組織等，而分化不成熟的間葉組織及神經(jīng)組織較多。 結論：異常核型的人類胚胎干細胞所致的畸胎瘤為不成熟畸胎瘤Ⅲ級，瘤體內存在很多未分化完全的組織和細胞，具有干細胞的特征，具有高增殖的潛能，具有向腫瘤、腫瘤干

10、細胞演進的趨勢。 第四章異常核型的人類胚胎干細胞向腫瘤演進分子機制的初步探討。 目的：分析異常核型的人類胚胎干細胞向腫瘤演進的分子機制 方法：收集正常核型，1 號染色體重復的、復雜核型的人類胚胎干細胞及畸胎癌細胞四種樣本，通過基因芯片進行基因表達譜的分析，對表達差異基因進行了染色體的定位分析和各染色體上表達率的分析，對具有表達差異的基因進行了生物學功能的分析、聚類分析及細胞信號傳導的分析。 結果：比較了正

11、常核型的chHES-20(P11)，1 號染色體異常的chHES-3 (P72)，復雜核型的 chHES-3 (P182)和人胚胎癌細胞(NTERA-2)的基因表達譜。在芯片的20387個基因中，以上四個樣本分別有12378、11001、11375和11096個基因表達，相對于其他三組來說，正常核型的人類胚胎干細胞表達較多的基因，而其他三組細胞基因表達數(shù)目相差不大。通過分析，正常核型的HES中有1176個基因特異的表達，1號染色體異常的

12、HES中有280個基因特異表達，而復雜核型的HES中有359個基因特異表達。由于1號染色體短臂的重復是所有異常核型chHES-3細胞的共同特點，為了了解染色體的變化是否與基因的表達存在一定的關系，我們把在三個HES中表達的差異基因利用 Visual inspection and initial statistical軟件進行了染色體的定位分析。1 號染色體異常的HES相對于正常核型而言，共有629個上調的基因，其中84個主要集中在1號染

13、色體短臂，特別是在1p32-36區(qū)域內，占13.35％。而發(fā)現(xiàn)的2504個下調基因則平均分散在所有的染色體上。復雜核型的HES細胞相對于正常核型的髓S細胞來說，有1285個基因上調，其中有206個基因主要集中在1號染色體上，有117個基因在1P32-36區(qū)域內，占9．1％；在全能性基因這一組，在所有樣本中都表達的，18個嚴格意義上的全能性相關基因及候選基因中，POU5F1、SOX2、Nanog、LDB2、GABRB3、FGFR4、LEF

14、TY2、DNMT3B、CD9 這九個基因漸進性的升高。在21個外胚層發(fā)育相關的基因中，F(xiàn)N1、MS12、NEDD1、SEPT2、NEFH、NEDD4、PAX6、OTX2、MCFD2、SOX3這九個基因；在28個與中胚層發(fā)育相關的基因中，EOMES、FLT1、GATA2、HLA-C、KDR、LMO2、MYLA、PECAM1、PITX2、RUNX1、T、THBS1、THBS2、VCAM1這 14 個基因；在七個和內胚層發(fā)育相關的基因中，AF

15、P、CER1、FOXA2、GATA4、GATA6 and HNF4A 這六個基因，它們都有下降的趨勢；在正常核性、異常核性與畸胎癌細胞中，我們全面的比較了重要信號傳導通路中分子的基因表達譜。在與Wnt信號傳導相關的差異基因中，在1號染色體異常的HES細胞和復雜核型的HES細胞中，效應分子 GSK-3beta 有一個明顯的下降；比較了四個樣本中的 Hst(FGFR1)、MDM2、BCL2、LMO2、ERBB2、TPM3、NTRK1、MET