蚊傳播腦脊髓炎病毒多重PCR——芯片實驗室集成檢測系統(tǒng)研究.pdf

1、蚊傳播腦炎病毒是一類感染對象廣泛危害嚴(yán)重的蟲媒病毒，其易感動物包括鳥、豬、馬，嚙齒動物和人類。東部型馬腦脊髓炎病毒、西部型馬腦脊髓炎病毒、委內(nèi)瑞拉型馬腦脊髓炎病毒、西尼羅河病毒、高地J病毒、拉科魯尼亞病毒、辛德畢斯病毒、日本腦炎病毒、圣劉易斯腦炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯尼亞熱、登革熱病毒等均在特定的地理區(qū)域危害公共衛(wèi)生安全。該類病原的相同特征均是通過吸血蚊類介導(dǎo)，引起特定的人畜群體的季節(jié)性、地方流行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和病毒血癥。

2、除日本腦炎、登革熱和基孔肯尼亞熱主要流行于東亞和非洲外，美洲大陸是上述大部分病原的疫源地和流行區(qū)域。但近年來，隨著國際貿(mào)易的發(fā)展，各個大陸間的人流物流的迅猛發(fā)展，蚊傳播腦炎病毒有從其疫源地向其它地理區(qū)域傳播擴(kuò)散的趨勢。目前，除日本腦炎外盡管我國尚未出現(xiàn)大面積流行，但我國卻廣泛存在上述病原的易感動物和傳播媒介。如果缺乏相應(yīng)的檢測防控技術(shù)，特別是高通量檢測方法，讓此類病原體自由通過人流/物流經(jīng)國境關(guān)口傳入，將會引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問題。為

3、此，本論文旨在建立一種新型的檢測方法，對此類病原進(jìn)行高通量的檢測，為保障國境口岸及國內(nèi)公共衛(wèi)生安全提供技術(shù)支撐。
　　本論文獲得的主要研究成果如下：
　　（1）以水泡性口炎病毒為載體，構(gòu)建了三株表達(dá)馬腦脊髓炎病毒 E2蛋白的重組病毒：rVSV-EEEV-E2、rVSV-WEEV-E2、 rVSV-VEEV-E2。重組病毒在BHK細(xì)胞上增殖良好，并通過電子顯微鏡、RT-PCR以及免疫熒光染色鑒定構(gòu)建正確。該重組病毒可以用作馬腦

4、脊髓炎病毒的替代物，用做檢測方法標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
　　（2）通過加尾 PCR法和體外轉(zhuǎn)錄的方法合成一系列新型的合成病毒 RNA（svRNA），并通過測序和RT-PCR驗證。由于svRNA的兩側(cè)帶有病毒特異性引物的結(jié)合區(qū)，內(nèi)部嵌入了來自于外源質(zhì)粒的基因片段，由此可以被用作后續(xù)檢測的病毒替代物，并具備驗證假陽性擴(kuò)增的能力。結(jié)果表明，svRNA可以作為基因檢測試劑盒陽性質(zhì)控樣本。
　　（3）應(yīng)用獨(dú)特的加尾法 PCR和聯(lián)用微流控電泳芯片，

5、開發(fā)了一種適用于基因檢測的WideSpace高通量擴(kuò)增方法。據(jù)此開發(fā)了WsP-mRT-PCR聯(lián)用Lab-on-Chip（芯片實驗室）檢測12種蚊傳播腦炎病毒的檢測方法包括：東部型馬腦脊髓炎病毒、西部型馬腦脊髓炎病毒、委內(nèi)瑞拉型馬腦脊髓炎病毒、西尼羅河病毒、高地J病毒、拉科魯尼亞病毒、辛德畢斯病毒、日本腦炎病毒、圣劉易斯腦炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯尼亞熱、Ⅲ型登革熱病毒。其中，東部型馬腦脊髓炎病毒、西部型馬腦脊髓炎病毒、委內(nèi)瑞拉型

6、馬腦脊髓炎病毒、西尼羅河病毒、高地J病毒和圣劉易斯腦炎病毒通過 OIE馬腦炎參考實驗室提供的標(biāo)準(zhǔn)病毒的測試和驗證。該方法的靈敏度為102拷貝/μL；方法的特異性和再現(xiàn)性均達(dá)到同類檢測方法的水平；方法的可靠性和熒光RT-PCR相當(dāng)；其優(yōu)勢在于可以同時高通量的檢測多個病原。
　　（4）開發(fā)了適用于病毒W(wǎng)sP-mRT-PCR檢測方法的分析軟件：《病毒特征判讀軟件V1.0》。該軟件基于基因擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度和長度可以對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行自動的分析和

7、結(jié)果報告。
　　（5）應(yīng)用本研究建立的檢測方法，對來自于重慶市三峽庫區(qū)五個縣鎮(zhèn)的2000余只蚊子進(jìn)行了本類病原的監(jiān)測。結(jié)果表明，有2/115(1.7％)的蚊子檢出乙型腦炎病毒，沒有發(fā)現(xiàn)東部型馬腦脊髓炎病毒、西部型馬腦脊髓炎病毒、委內(nèi)瑞拉型馬腦脊髓炎病毒、西尼羅河病毒、高地J病毒、拉科魯尼亞病毒、辛德畢斯病毒、日本腦炎病毒、圣劉易斯腦炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯尼亞熱、Ⅲ型登革熱病毒中的任何一種。
　?。?）通過項目研究