委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒核酸與抗體快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、R e s e a r c h o f r a p i d d e t e c t i o no fV e n e z u e l a n e q u i n ee n c e p h a l i t i sV “ I Fl r U S一 一 ● o ?‘ ●n u c l e i c a c i da n da n t i b o d y U c l e i caT h e s i ss u b m i t t e d t oQ i

2、n g d a o A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yI n F u l f i l l m e n t o f t h e R e q u i r e m e n tf o rt h eD e g r e e o fM a s t e r o f A g r o n o m yY u J u n c h a o( D e p a r t m e n t o f A n i m a l

3、S c i e n c ea n d V e t e r i n a r y M e d i c i n e )S u p e r v i s o r ：P r o f ．Z h a n g L e c u iP r o f ．Z h a n g H e x i a o青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒核酸與抗體快速檢測技術(shù)研究摘要委內(nèi)瑞拉馬腦炎( V e n e z u e l a ne q u i n ee n c

4、 e p h a l i t i s ，V E E ) 是由委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒( V e n e z u e l a n e q u i n ee n c e p h a l i t i sv i l x I S ，ⅦE V ) 引起的自然疫源性疾病，本病危害人類的健康，并且可以造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究成功克隆并表達(dá)了V E E V 結(jié)構(gòu)蛋白E 2 基因，利用原核表達(dá)的重組E 2 蛋白成功建立了檢測V E E V 結(jié)構(gòu)蛋白I g M

5、抗體的間接E L I S A 方法，并且利用T a q M a n 技術(shù)建立了V E E V 的實時定量R T - P C R 檢測方法。以委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒( ⅦE V ) E 2 基因為目的基因，設(shè)計一對特異性引物，擴(kuò)增目的序列，然后克隆至原核表達(dá)載體p E T - 3 2 a ，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p E T - E 2 。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌R o s e t t a 后，經(jīng)1 m m o l ／L I P T G 誘導(dǎo)E 2 目

6、的蛋白表達(dá)。純化后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)S D S - P A G E 電泳，得到5 0 K D 左右的清晰的蛋白條帶，符合預(yù)期結(jié)果。W e s t e r n - b l o t分析證明，重組蛋白可被委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒陽性血清所識別。以純化的重組蛋白E 2 為抗原，建立了檢測E 2 蛋白抗體的間接E L I S A 方法，確定了間接E L I S A 方法的最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明，重組E 2 蛋白的最適包被濃度為1 ：1 0 0 ；待檢血清的最

7、適稀釋度為1 ：2 0 0 ；重組蛋白最適包被條件為4 ℃過夜；最佳封閉液為2 ％明膠；血清樣本的陰陽性臨界值為O ．5 3 2 2 ．交叉反應(yīng)試驗和敏感性試驗證明該方法特異性強、敏感性高。本試驗還建立了快速檢測v E E V 的熒光定量R T - P C R 方法。根據(jù)V E E V E 2 基因，利用O l i 9 0 6 ．3 軟件設(shè)計了引物和T a q M a n 探針，通過優(yōu)化各項反應(yīng)條件，建立了實時熒光定量R T - P C