吖啶酮類化合物L(fēng)ZY13逆轉(zhuǎn)人白血病K562-ADM細(xì)胞多藥耐藥作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：篩選新型吖啶酮類化合物 LZY13作為逆轉(zhuǎn)劑，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的體外逆轉(zhuǎn)作用，并探討其可能的逆轉(zhuǎn)作用機(jī)制。
　　方法：以人白血病K562細(xì)胞和耐阿霉素人白血病K562/ADM細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用MTT法檢測(cè)LZY13和阿霉素（ADM）對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，測(cè)定K562/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥倍數(shù)；應(yīng)用MTT法篩選出LZY13對(duì)K562和K562/ADM細(xì)胞的無(wú)毒劑量，檢測(cè)其對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞耐藥性的體外逆轉(zhuǎn)作用；

2、應(yīng)用高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)LZY13對(duì)K562和K562/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM和羅丹明123（Rh123）蓄積的影響；應(yīng)用MTT法檢測(cè)LZY13聯(lián)用抑制劑后對(duì)K562/ADM細(xì)胞增殖的影響，并進(jìn)一步觀察LZY13發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用可能的信號(hào)通路；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析LZY13對(duì)ADM誘導(dǎo)K562/ADM細(xì)胞凋亡、自噬和活性氧（ROS）產(chǎn)生的影響；應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)LZY13對(duì)人白血病耐藥細(xì)胞K562/ADM中P-gp以及抑癌基

3、因p53等相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，ADM對(duì)K562和K562/ADM細(xì)胞的IC50值分別為（1.06±0.12） mg/L和（74.15±6.52）mg/L，K562/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥倍數(shù)為70倍。MTT結(jié)果表明，當(dāng)LZY13的濃度在1μmol/L及其以下劑量時(shí)，其對(duì)兩種細(xì)胞的抑制率均小于10％，對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。因此，1μmol/L及其以下濃度為L(zhǎng)ZY13的無(wú)毒劑量。MTT法檢測(cè)顯示，LZ

4、Y13在無(wú)毒劑量（0.1~1μmol/L）下能夠劑量依賴性地降低ADM對(duì)耐藥細(xì)胞 K562/ADM的 IC50值，在體外成功逆轉(zhuǎn)了人白血病耐藥細(xì)胞K562/ADM對(duì)ADM的耐受性，且其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)呈劑量依賴性地增加。同等濃度（1μmol/L）下，LZY13的逆轉(zhuǎn)作用比陽(yáng)性對(duì)照藥維拉帕米（Verapamil）強(qiáng)59.88倍，逆轉(zhuǎn)效果明顯優(yōu)于后者。阿霉素蓄積實(shí)驗(yàn)和羅丹明蓄積實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LZY13可劑量依賴性地增加多藥耐藥細(xì)胞K562/ADM細(xì)

5、胞內(nèi)ADM、Rh123的蓄積量。流式細(xì)胞術(shù)和MTT結(jié)果顯示，LZY13（0.5?M）與ADM（10 mg/L）聯(lián)用以后，人白血病耐藥細(xì)胞 K562/ADM的凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加，用 caspase家族抑制劑Z-VAD-FMK處理細(xì)胞后，LZY13與ADM聯(lián)用組的細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞抑制率均明顯下降。MDC染色和MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，LZY13可促進(jìn)ADM誘導(dǎo)K562/ADM細(xì)胞發(fā)生自噬，LZY13與ADM聯(lián)用后，MDC染色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，K5

6、62/ADM細(xì)胞自噬比率明顯增加，相應(yīng)地其細(xì)胞抑制率也明顯升高；加入3-MA后，LZY13與ADM聯(lián)用組的細(xì)胞自噬比率及細(xì)胞抑制率均顯著降低。細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)結(jié)果顯示，LZY13與ADM聯(lián)用后，DCF染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多即細(xì)胞內(nèi) ROS含量顯著增加，同時(shí)其細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率亦明顯升高；加入抗氧化劑Catalase處理細(xì)胞后，K562/ADM細(xì)胞內(nèi)ROS含量及其細(xì)胞抑制率均顯著下降。通過(guò)Western Blot分析可知，耐藥細(xì)胞K562/

7、ADM中P-gp蛋白呈高表達(dá)，經(jīng)LZY13與ADM聯(lián)用處理后的細(xì)胞，P-gp蛋白的表達(dá)顯著下降；另外，LZY13與ADM聯(lián)用后，抑癌基因p53的表達(dá)增多，加入Pifithrin-α處理細(xì)胞后，p53的表達(dá)明顯下降。
　　結(jié)論：吖啶酮類化合物L(fēng)ZY13在體外可有效逆轉(zhuǎn)人白血病耐藥細(xì)胞K562/ADM對(duì)ADM的耐受性，能夠有效恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。LZY13逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的作用機(jī)制可能是與抑制 P-gp蛋白的藥物外排功