環(huán)孢素A聯(lián)合三氧化二砷對(duì)K562-ADM細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)耐藥作用.pdf

1、目的：化療是白血病治療的基本手段，能夠抑制白血病的進(jìn)展，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在化療之后，對(duì)抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療失敗或腫瘤復(fù)發(fā)。多藥耐藥(MDR)指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的其他抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性的現(xiàn)象[1]。MDR是導(dǎo)致腫瘤化療失敗或腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因之一，目前克服多藥耐藥仍然是一個(gè)較大的挑戰(zhàn)。多數(shù)情況下應(yīng)用一種逆轉(zhuǎn)劑效果欠佳，應(yīng)用劑量大時(shí)增強(qiáng)毒副作用，限

2、制了臨床的應(yīng)用。目前已有研究表明[14，15，21，22]環(huán)孢素A和三氧化二砷單獨(dú)應(yīng)用對(duì)多藥耐藥有一定的逆轉(zhuǎn)作用，但兩藥聯(lián)合應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用WST-1法測(cè)定環(huán)孢素A和三氧化二砷對(duì)具有多藥耐藥表型的人白血病細(xì)胞株K562/ADM細(xì)胞的非細(xì)胞毒性劑量，聯(lián)合兩藥作用于K562/ADM細(xì)胞，觀察逆轉(zhuǎn)耐藥的療效，并應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)MDR1mRNA、hMLH1mRNA的表達(dá)量，及免疫組化法檢測(cè)P-gp、hMLH1蛋白的表達(dá)量，探討其逆

3、轉(zhuǎn)機(jī)制，為其以后臨床應(yīng)用提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，同時(shí)為難治、復(fù)發(fā)腫瘤的治療提供新的治療思路。
　　 方法：
　　 1.水溶性四唑鹽光吸收(WST-1)法檢測(cè)環(huán)孢素A和(或)三氧化二砷對(duì)K562細(xì)胞、K562/ADM細(xì)胞的毒性及其作用后的逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)。
　　 2.RT-PCR法檢測(cè)各組MDR1mRNA、hMLH1mRNA的表達(dá)：(1)K562細(xì)胞組，(2)K562/ADM細(xì)胞組，(3)非細(xì)胞毒性劑量環(huán)孢素A及三氧化二

4、砷聯(lián)合作用于K562/ADM細(xì)胞組(K562/ADM+CSA非細(xì)胞毒性劑量+As2O3非細(xì)胞毒性劑量)。
　　 3.免疫組化法檢測(cè)各組P-gp、hMLH1蛋白的表達(dá)：(1)K562細(xì)胞組，(2)K562/ADM細(xì)胞組，(3)非細(xì)胞毒性劑量環(huán)孢素A及三氧化二砷聯(lián)合作用于K562/ADM細(xì)胞組(K562/ADM+CSA非細(xì)胞毒性劑量+As2O3非細(xì)胞毒性劑量)。
　　 4.統(tǒng)計(jì)分析：所得結(jié)果應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理

5、，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)分析，多樣本均數(shù)的比較在方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1.WST-1結(jié)果顯示：(1)ADM IC50值在K562細(xì)胞、K562/ADM細(xì)胞分別是1.06±0.019μg/ml、32.47±0.012μg/ml，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后有顯著性差異(P<0.05)，K562/ADM細(xì)胞的耐藥

6、倍數(shù)為30.63。CSA IC50值在K562細(xì)胞、K562/ADM細(xì)胞分別是0.357±0.018μg/ml、0.372±0.016μg/ml，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后無(wú)顯著性差異(P>0.05)，K562/ADM細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為1.04。As2O3IC50值在K562細(xì)胞、K562/ADM細(xì)胞分別是0.733±0.142μg/ml、0.923±0.232μg/ml，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后無(wú)顯著性差異(P>0.05)，K562/ADM細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為1.2

7、6。(2)非細(xì)胞毒性劑量的CSA(0.0005μg/ml)和As2O3(0.002μg/ml)單獨(dú)應(yīng)用，ADM對(duì)K562/ADM細(xì)胞的IC50分別降至20.52±2.34μg/ml和21.62±1.81μg/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.58倍和1.50倍。非細(xì)胞毒性劑量的CSA與As2O3聯(lián)合作用于K562/ADM細(xì)胞，IC50降至9.63±1.57μg/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.37倍。
　　 2.RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示：(1)K56

8、2細(xì)胞組與K562/ADM細(xì)胞組比較，MDR-1mRNA的表達(dá)減少，差異有顯著性(P<0.05)，K562/ADM+CSA非細(xì)胞毒性劑量+As2O3非細(xì)胞毒性劑量組與K562/ADM細(xì)胞組比較，MDR-1 mRNA的表達(dá)下調(diào)，差異有顯著性(P<0.05)，K562細(xì)胞組與K562/ADM+CSA非細(xì)胞毒性劑量+As2O3非細(xì)胞毒性劑量組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。(2)K562細(xì)胞組與K562/ADM細(xì)胞組比較，hMLH1 mRN

9、A的表達(dá)增多，差異有顯著性(P<0.05)，K562/ADM+CSA非細(xì)胞毒性劑量+As2O3非細(xì)胞毒性劑量組與K562/ADM細(xì)胞組比較，hMLH1 mRNA的表達(dá)上調(diào)，差異有顯著性(P<0.05)，K562細(xì)胞組與K562/ADM+CSA非細(xì)胞毒性劑量+As2O3非細(xì)胞毒性劑量組比較差異無(wú)顯著性(P<0.05)。
　　 3.免疫組化法染色法檢測(cè)結(jié)果顯示：1)K562細(xì)胞組與K562/ADM細(xì)胞組比較，P-gp表達(dá)減少，差異有

10、顯著性(P<0.05)，K562/ADM+CSA非細(xì)胞毒性劑量+As2O3非細(xì)胞毒性劑量組與K562/ADM細(xì)胞組比較，P-gp表達(dá)下調(diào)，差異有顯著性(P<0.05)，K562細(xì)胞組與K562/ADM+CSA非細(xì)胞毒性劑量+As2O3非細(xì)胞毒性劑量組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。(2)K562細(xì)胞組與K562/ADM細(xì)胞組比較，hMLH1蛋白表達(dá)增多，差異有顯著性(P<0.05)，K562/ADM+CSA非細(xì)胞毒性劑量+As2O3非

11、細(xì)胞毒性劑量組與K562/ADM細(xì)胞組比較，hMLH1蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有顯著性(P<0.05)，K562細(xì)胞組與K562/ADM+CSA非細(xì)胞毒性劑量+As2O3非細(xì)胞毒性劑量組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.環(huán)孢素A和三氧化二砷能抑制K562、K562/ADM細(xì)胞的增殖，K562/ADM細(xì)胞對(duì)環(huán)孢素A和三氧化二砷不具有耐藥性。
　　 2.非細(xì)胞毒性劑量的環(huán)孢素A和三氧化二砷聯(lián)合作用