艾拉莫德在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移骨破壞中的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　骨是惡性腫瘤最常累及的轉(zhuǎn)移部位之一，骨轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并常與不良預(yù)后相關(guān)。隨著對(duì)骨轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制及對(duì)骨微環(huán)境中“惡性循環(huán)”的深入了解，骨轉(zhuǎn)移的治療開啟了新篇章。腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)被認(rèn)為是導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)移骨破壞的主要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞于骨微環(huán)境內(nèi)釋放多種活性因子，包括PTHrP、TNF-α、IL-1β、IL-6和RANKL等，它們可以直接作用于破骨前體細(xì)胞，或間接通過促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌RANKL

2、激活破骨前體細(xì)胞內(nèi)的NF-κB等通路，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化，增強(qiáng)溶骨作用。艾拉莫德是一種抗風(fēng)濕新藥，臨床前研究表明其具有抗炎、抗細(xì)胞因子、抑制 NF-κB活性的作用。由于活化的破骨細(xì)胞是骨轉(zhuǎn)移骨破壞的主要執(zhí)行者，而炎癥因子是骨微環(huán)境內(nèi)增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性的重要組分之一。我們推測艾拉莫德可能通過抗炎癥因子及抑制破骨細(xì)胞激活的作用發(fā)揮對(duì)骨轉(zhuǎn)移骨破壞的治療效果。因此，我們擬分別在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中研究艾拉莫德對(duì)骨轉(zhuǎn)移骨破壞的影響及其可能的作用機(jī)制。

3、>　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、建立大鼠脛骨腫瘤種植模型，研究艾拉莫德對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移骨破壞的影響。
　　于大鼠左側(cè)脛骨內(nèi)接種大鼠乳腺癌Walker256細(xì)胞建立腫瘤種植模型。分組給予安慰劑或艾拉莫德治療。運(yùn)用X線攝片、H&E染色的方法對(duì)大鼠脛骨骨破壞情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，運(yùn)用TRAP染色對(duì)大鼠脛骨內(nèi)破骨細(xì)胞活化水平進(jìn)行檢測，同時(shí)在模型建立前后檢測大鼠左后肢機(jī)械痛閾的變化。
　　2、體外培養(yǎng)破骨前體細(xì)胞，研究艾拉莫德對(duì)破骨細(xì)胞分化激活

4、的影響及其機(jī)制。
　　分離并培養(yǎng)小鼠骨髓單核巨噬細(xì)胞，加入RANKL誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，同時(shí)予以艾拉莫德處理，用 TRAP染色的方法檢測艾拉莫德對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。Western blot免疫印跡法檢測RANKL刺激后細(xì)胞內(nèi)RANK受體下游NF-κB和MAPK通路的激活狀態(tài)，以及轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和NFATc1的表達(dá)水平。最后用qRT-PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)NFATc1及其靶基因mRNA的表達(dá)水平。
　　3、研究艾拉莫德對(duì)乳

5、腺癌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)、細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的影響。qRT-PCR法檢測艾拉莫德對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響，并運(yùn)用Western blot免疫印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65的激活情況。隨后在兩種人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7中檢測艾拉莫德對(duì)其增殖、遷移、侵襲的影響。用CCK-8法檢測艾拉莫德對(duì)細(xì)胞增殖的作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測艾拉莫德對(duì)兩種細(xì)胞周期分布的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)

6、驗(yàn)檢測艾拉莫德對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、完成給藥后，大鼠左側(cè)脛骨 X線檢查和 H&E染色的結(jié)果顯示接受艾拉莫德治療的大鼠脛骨骨破壞程度較安慰劑組減輕，同時(shí)治療后大鼠的左后肢機(jī)械痛覺過敏情況較安慰劑組改善。對(duì)大鼠左側(cè)脛骨的TRAP染色發(fā)現(xiàn)艾拉莫德治療組大鼠的脛骨內(nèi)活化的破骨細(xì)胞數(shù)目少于安慰劑組。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)表明艾拉莫德顯著抑制了破骨細(xì)胞的分化。并且細(xì)胞活力檢測提示此抑制效應(yīng)并非由艾拉莫德對(duì)細(xì)

7、胞生長的抑制引起。信號(hào)通路的相關(guān)檢測結(jié)果顯示艾拉莫德顯著抑制了RANKL誘導(dǎo)的破骨前體細(xì)胞內(nèi)NF-κB和MAPK通路的激活，并下調(diào)了轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和NFATc1的水平，減少了破骨細(xì)胞功能相關(guān)基因Cathepsin K、MMP-9和TRAP的表達(dá)。
　　3、qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示艾拉莫德使MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IL-1β、IL-6的水平下降，但對(duì)RANKL的表達(dá)沒有顯著影響，同時(shí)藥物處

8、理后細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65的磷酸化水平也下降。此外，艾拉莫德只在高濃度（30μg/ml）時(shí)輕度抑制了MDA-MB-231以及MCF-7細(xì)胞的增殖，而與對(duì)照組相比，艾拉莫德對(duì)兩種乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布、遷移和侵襲能力均沒有顯著影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1、艾拉莫德使乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠的骨破壞程度減輕，并使其機(jī)械性痛覺過敏癥狀得到一定改善。
　　2、艾拉莫德緩解骨破壞的機(jī)制之一可能是其抑制了 RANKL誘導(dǎo)的破骨前體細(xì)