Hsa-miR-365a對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用及其機(jī)制.pdf

1、立項(xiàng)依據(jù):
　　 MicroRNA(miRNA)通過(guò)與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)特異性結(jié)合誘導(dǎo)靶基因mRNA的降解或阻遏其翻譯。c-Myc作為一種重要的癌癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、惡性轉(zhuǎn)化和凋亡等過(guò)程中起重要作用。近期的研究表明，c-Myc也可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。我們利用生物信息學(xué)方法從已知的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，預(yù)測(cè)到大量miRNA受c-Myc調(diào)控，其中受c-Myc直接調(diào)控的110

2、個(gè)miRNA位于基因的內(nèi)含子和107個(gè)miRNA位于基因之間。根據(jù)我們?cè)O(shè)定的篩選條件如miRNA表達(dá)水平較高（reads數(shù)大于4）、具有c-Myc的結(jié)合位點(diǎn)(motif＞0)、TSS即E-box與miRNA結(jié)合位點(diǎn)距離較近（5kb以內(nèi)）以及FDR值即轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的調(diào)控強(qiáng)度較大（小于0.05）等，共選出5個(gè)位于基因內(nèi)的miRNA和16個(gè)位于基因間的miRNA。最后經(jīng)過(guò)Q-PCR驗(yàn)證以及miRNA的可能作用靶點(diǎn)分析，確定has-miR-3

3、65a作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并系統(tǒng)探討其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長(zhǎng)的作用及其分子機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.c-Myc特異性siRNA可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的c-Myc表達(dá)，其抑制mRNA表達(dá)的強(qiáng)度達(dá)80％以上，對(duì)蛋白也有明顯的抑制作用。血清依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和飽和密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明，c-Myc特異性siRNA介導(dǎo)的c-Myc表達(dá)抑制可使MCF-7的增殖明顯減緩。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，抑制MCF-7的c-Myc表

4、達(dá)可顯著升高細(xì)胞內(nèi)has-miR-365a水平。
　　 2.我們?cè)谘逡蕾囆约?xì)胞生長(zhǎng)和飽和密度實(shí)驗(yàn)，以及活細(xì)胞檢測(cè)等觀測(cè)到，Has-miR-365a模擬物(mimic)可明顯抑制MCF-7的惡性增殖，而其抑制劑(inhibitor)則可幾乎完全取消has-miR-365a的作用。
　　 3.Has-miR-365a模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor)可分別顯著抑制和取消has-mir-365a的靶基因HSP

5、A8（編碼蛋白是Hsc70）的表達(dá)，luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也證明，has-mir-365a（模擬物）可特異性地作用于HSPA8的3'UTR區(qū)域，進(jìn)而抑制靶基因的翻譯。
　　 討論與結(jié)論:
　　 c-Myc通過(guò)miRNA調(diào)節(jié)途徑而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程已引起人們的高度關(guān)注。HSPA8是熱休克蛋白70(HSP70)家族一員，編碼73kDa的熱休克同源蛋白Hsc70，后者在促進(jìn)蛋白折疊及維持其正常的結(jié)構(gòu)和功能中都扮演

6、著重要的角色。以往的工作表明，Hsc70無(wú)論是正常狀態(tài)或是應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)維持蛋白的動(dòng)態(tài)平衡——如轉(zhuǎn)運(yùn)、組裝、降解等過(guò)程中起關(guān)鍵作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，c-Myc調(diào)控的has-mir-365a對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長(zhǎng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)我們的結(jié)果還證明，has-mir-365a對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用是通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因HSPA8(Hsc70)而實(shí)現(xiàn)的。因此，我們得出結(jié)論:c-Myc調(diào)控的has-mir-365a-Hsc70途徑在