喜樹堿抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的表達譜基因芯片研究.pdf

1、喜樹堿是及其衍生物是臨床上常用的抗腫瘤藥物，對多種腫瘤具有療效，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、胃癌、肝癌、膀胱癌以及白血病等惡性腫瘤。Topol被確認(rèn)為是喜樹堿類藥物的獨特靶點。目前關(guān)于喜樹堿類藥物機理的研究表明，喜樹堿類一般是通過形成DNA-TOPOl一藥物中間體，誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA雙鏈損傷，進而誘導(dǎo)細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)，起到抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，但信號傳導(dǎo)的本質(zhì)并不清楚。 表達譜基因芯片技術(shù)是近

2、年來發(fā)展起來的用于基因功能研究的一種基因芯片，具高通量、縮微、多參數(shù)、集約化、平行化等優(yōu)點。通過雙色熒光標(biāo)記和掃描，可以全面監(jiān)測基因在不同組織或細(xì)胞、不同發(fā)育階段以及不同因素刺激下的差異表達情況。有報道顯示利用這項技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多新的分子內(nèi)通路或調(diào)節(jié)因子．具有相同藥理或毒理作用的化合物體內(nèi)或體外處理細(xì)胞會誘導(dǎo)相似的基因表達譜。 本研究利用基因芯片的大規(guī)模同步檢測的特點，檢測多種喜樹堿敏感性腫瘤細(xì)胞系的早期基因表達變化，尋找的喜樹

3、堿共同反應(yīng)通路，然后通過對共同通路的闡述以進一步了解CPT的分子作用機制。整個研究分為3個實驗部分。第一部分采用MTT檢測、形態(tài)學(xué)檢測、流式細(xì)胞儀檢測等方法，進行喜樹堿誘導(dǎo)HL一60急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞、K562急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株、Hela宮頸癌細(xì)胞、QGY一7700肝癌細(xì)胞及SGC7901胃腺癌細(xì)胞凋亡的研究。實驗表明，喜樹堿能夠有效抑制這五種腫瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并具有G2/M期阻滯的趨勢。5種腫瘤細(xì)胞對喜樹堿的敏

4、感性依次為HL60>K562>QGY7703>SGC7901>Hela。 在第二部分中，我們利用自制的14400點CDNA芯片檢測了4種腫瘤細(xì)胞系K562(chronicmyeIogenousIeukemia)，HeIa(CeⅣixAdenocarcinoma)，SGC7901(GastriccancenandHL60(HumanpromyeIocyticIeukemia)經(jīng)喜樹堿處理后的早期基因表達圖譜。每種細(xì)胞以各自的24

5、小時半數(shù)抑制濃度lC50作為處理濃度。處理時間1小時。對基因芯片結(jié)果，采用實時PCR進行了驗證。芯片檢測到535條基因在2種以上的細(xì)胞系中發(fā)生了同向表達變化。其中29條下調(diào)基因為所有細(xì)胞系中共有，參與了DNA復(fù)制和修復(fù)，蛋白質(zhì)合成，能量代謝，proteasome依賴的蛋白質(zhì)降解，信號傳導(dǎo)通路等重要的細(xì)胞生命活動以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體等構(gòu)成。在29條共表達基因中，有多條基因，例如MCM7，DDB1，AKTl等，是DNA損傷修復(fù)的ATR／AT

6、M復(fù)制監(jiān)控系統(tǒng)的反應(yīng)基因。此外，線粒體依賴的凋亡途徑中重要基因ANT3的表達在所有反應(yīng)中均受到顯著影響，提示線粒體依賴的凋亡途徑是CPT抑瘤作用的重要機制。 第三部分，構(gòu)建了ANT3基因表達質(zhì)粒和合成了ANT3干擾RNA(siRNA)，以人肝癌細(xì)胞株QGY7703為體外模型，觀察瞬時抑制ANT3基因表達和瞬時過表達ANT3基因?qū)GY7703細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及線粒體膜通透性(MMP)的影響。實驗結(jié)果表明，CPT能

7、夠誘導(dǎo)QGY7703腫瘤細(xì)胞的線粒體膜電位降低、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；。ANT3的過表達可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而通過siRNA抑制ANT3基因表達卻可以促進細(xì)胞的增殖作用。實驗還發(fā)現(xiàn)，ANT3的過表達能夠應(yīng)該誘導(dǎo)線粒體膜電位顯著降低。結(jié)合第一部分和第二部分實驗結(jié)果，使得我們認(rèn)為線粒體以及線粒體依賴的凋亡途徑在CPT誘導(dǎo)的K562，HL60，Hela，SGC7901以后QGY7703細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，這對我們進一步了解CPT抗瘤機理很有啟示