喜樹(shù)堿抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的表達(dá)譜基因芯片研究.pdf

1、喜樹(shù)堿是及其衍生物是臨床上常用的抗腫瘤藥物，對(duì)多種腫瘤具有療效，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、胃癌、肝癌、膀胱癌以及白血病等惡性腫瘤。Topol被確認(rèn)為是喜樹(shù)堿類(lèi)藥物的獨(dú)特靶點(diǎn)。目前關(guān)于喜樹(shù)堿類(lèi)藥物機(jī)理的研究表明，喜樹(shù)堿類(lèi)一般是通過(guò)形成DNA-TOPOl一藥物中間體，誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA雙鏈損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)，起到抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，但信號(hào)傳導(dǎo)的本質(zhì)并不清楚。 表達(dá)譜基因芯片技術(shù)是近

2、年來(lái)發(fā)展起來(lái)的用于基因功能研究的一種基因芯片，具高通量、縮微、多參數(shù)、集約化、平行化等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)雙色熒光標(biāo)記和掃描，可以全面監(jiān)測(cè)基因在不同組織或細(xì)胞、不同發(fā)育階段以及不同因素刺激下的差異表達(dá)情況。有報(bào)道顯示利用這項(xiàng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多新的分子內(nèi)通路或調(diào)節(jié)因子．具有相同藥理或毒理作用的化合物體內(nèi)或體外處理細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)相似的基因表達(dá)譜。 本研究利用基因芯片的大規(guī)模同步檢測(cè)的特點(diǎn)，檢測(cè)多種喜樹(shù)堿敏感性腫瘤細(xì)胞系的早期基因表達(dá)變化，尋找的喜樹(shù)

3、堿共同反應(yīng)通路，然后通過(guò)對(duì)共同通路的闡述以進(jìn)一步了解CPT的分子作用機(jī)制。整個(gè)研究分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)部分。第一部分采用MTT檢測(cè)、形態(tài)學(xué)檢測(cè)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)等方法，進(jìn)行喜樹(shù)堿誘導(dǎo)HL一60急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞、K562急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株、Hela宮頸癌細(xì)胞、QGY一7700肝癌細(xì)胞及SGC7901胃腺癌細(xì)胞凋亡的研究。實(shí)驗(yàn)表明，喜樹(shù)堿能夠有效抑制這五種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并具有G2/M期阻滯的趨勢(shì)。5種腫瘤細(xì)胞對(duì)喜樹(shù)堿的敏

4、感性依次為HL60>K562>QGY7703>SGC7901>Hela。 在第二部分中，我們利用自制的14400點(diǎn)CDNA芯片檢測(cè)了4種腫瘤細(xì)胞系K562(chronicmyeIogenousIeukemia)，HeIa(CeⅣixAdenocarcinoma)，SGC7901(GastriccancenandHL60(HumanpromyeIocyticIeukemia)經(jīng)喜樹(shù)堿處理后的早期基因表達(dá)圖譜。每種細(xì)胞以各自的24

5、小時(shí)半數(shù)抑制濃度lC50作為處理濃度。處理時(shí)間1小時(shí)。對(duì)基因芯片結(jié)果，采用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。芯片檢測(cè)到535條基因在2種以上的細(xì)胞系中發(fā)生了同向表達(dá)變化。其中29條下調(diào)基因?yàn)樗屑?xì)胞系中共有，參與了DNA復(fù)制和修復(fù)，蛋白質(zhì)合成，能量代謝，proteasome依賴的蛋白質(zhì)降解，信號(hào)傳導(dǎo)通路等重要的細(xì)胞生命活動(dòng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體等構(gòu)成。在29條共表達(dá)基因中，有多條基因，例如MCM7，DDB1，AKTl等，是DNA損傷修復(fù)的ATR／AT

6、M復(fù)制監(jiān)控系統(tǒng)的反應(yīng)基因。此外，線粒體依賴的凋亡途徑中重要基因ANT3的表達(dá)在所有反應(yīng)中均受到顯著影響，提示線粒體依賴的凋亡途徑是CPT抑瘤作用的重要機(jī)制。 第三部分，構(gòu)建了ANT3基因表達(dá)質(zhì)粒和合成了ANT3干擾RNA(siRNA)，以人肝癌細(xì)胞株QGY7703為體外模型，觀察瞬時(shí)抑制ANT3基因表達(dá)和瞬時(shí)過(guò)表達(dá)ANT3基因?qū)GY7703細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及線粒體膜通透性(MMP)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CPT能

7、夠誘導(dǎo)QGY7703腫瘤細(xì)胞的線粒體膜電位降低、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；。ANT3的過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而通過(guò)siRNA抑制ANT3基因表達(dá)卻可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，ANT3的過(guò)表達(dá)能夠應(yīng)該誘導(dǎo)線粒體膜電位顯著降低。結(jié)合第一部分和第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使得我們認(rèn)為線粒體以及線粒體依賴的凋亡途徑在CPT誘導(dǎo)的K562，HL60，Hela，SGC7901以后QGY7703細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，這對(duì)我們進(jìn)一步了解CPT抗瘤機(jī)理很有啟示