喜樹堿抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的表達譜基因芯片研究.pdf

1、喜樹堿是及其衍生物是臨床上常用的抗腫瘤藥物，對多種腫瘤具有療效，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、黑色素瘤、胃癌、肝癌、膀胱癌以及白血病等惡性腫瘤。Topol被確認為是喜樹堿類藥物的獨特靶點。目前關于喜樹堿類藥物機理的研究表明，喜樹堿類一般是通過形成DNA-TOPOl一藥物中間體，誘導產生DNA雙鏈損傷，進而誘導細胞分化、細胞凋亡或細胞周期阻滯效應，起到抑制或殺傷腫瘤細胞的作用，但信號傳導的本質并不清楚。 表達譜基因芯片技術是近

2、年來發(fā)展起來的用于基因功能研究的一種基因芯片，具高通量、縮微、多參數、集約化、平行化等優(yōu)點。通過雙色熒光標記和掃描，可以全面監(jiān)測基因在不同組織或細胞、不同發(fā)育階段以及不同因素刺激下的差異表達情況。有報道顯示利用這項技術發(fā)現了許多新的分子內通路或調節(jié)因子．具有相同藥理或毒理作用的化合物體內或體外處理細胞會誘導相似的基因表達譜。 本研究利用基因芯片的大規(guī)模同步檢測的特點，檢測多種喜樹堿敏感性腫瘤細胞系的早期基因表達變化，尋找的喜樹

3、堿共同反應通路，然后通過對共同通路的闡述以進一步了解CPT的分子作用機制。整個研究分為3個實驗部分。第一部分采用MTT檢測、形態(tài)學檢測、流式細胞儀檢測等方法，進行喜樹堿誘導HL一60急性早幼粒細胞白血病細胞、K562急性髓細胞性白血病細胞株、Hela宮頸癌細胞、QGY一7700肝癌細胞及SGC7901胃腺癌細胞凋亡的研究。實驗表明，喜樹堿能夠有效抑制這五種腫瘤細胞的生長，誘導細胞凋亡，并具有G2/M期阻滯的趨勢。5種腫瘤細胞對喜樹堿的敏

4、感性依次為HL60>K562>QGY7703>SGC7901>Hela。 在第二部分中，我們利用自制的14400點CDNA芯片檢測了4種腫瘤細胞系K562(chronicmyeIogenousIeukemia)，HeIa(CeⅣixAdenocarcinoma)，SGC7901(GastriccancenandHL60(HumanpromyeIocyticIeukemia)經喜樹堿處理后的早期基因表達圖譜。每種細胞以各自的24

5、小時半數抑制濃度lC50作為處理濃度。處理時間1小時。對基因芯片結果，采用實時PCR進行了驗證。芯片檢測到535條基因在2種以上的細胞系中發(fā)生了同向表達變化。其中29條下調基因為所有細胞系中共有，參與了DNA復制和修復，蛋白質合成，能量代謝，proteasome依賴的蛋白質降解，信號傳導通路等重要的細胞生命活動以及內質網以及線粒體等構成。在29條共表達基因中，有多條基因，例如MCM7，DDB1，AKTl等，是DNA損傷修復的ATR／AT

6、M復制監(jiān)控系統(tǒng)的反應基因。此外，線粒體依賴的凋亡途徑中重要基因ANT3的表達在所有反應中均受到顯著影響，提示線粒體依賴的凋亡途徑是CPT抑瘤作用的重要機制。 第三部分，構建了ANT3基因表達質粒和合成了ANT3干擾RNA(siRNA)，以人肝癌細胞株QGY7703為體外模型，觀察瞬時抑制ANT3基因表達和瞬時過表達ANT3基因對QGY7703細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期以及線粒體膜通透性(MMP)的影響。實驗結果表明，CPT能

7、夠誘導QGY7703腫瘤細胞的線粒體膜電位降低、誘導細胞凋亡；。ANT3的過表達可以誘導細胞凋亡，而通過siRNA抑制ANT3基因表達卻可以促進細胞的增殖作用。實驗還發(fā)現，ANT3的過表達能夠應該誘導線粒體膜電位顯著降低。結合第一部分和第二部分實驗結果，使得我們認為線粒體以及線粒體依賴的凋亡途徑在CPT誘導的K562，HL60，Hela，SGC7901以后QGY7703細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，這對我們進一步了解CPT抗瘤機理很有啟示