PAMAM納米轉(zhuǎn)運(yùn)體系在體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)運(yùn)及白血病基因治療中的應(yīng)用.pdf

1、對(duì)疾病的預(yù)防和治療來(lái)講，基因治療是一種有效和經(jīng)濟(jì)的方法。高效的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)是基因治療的關(guān)鍵技術(shù)。目前常用的基因載體包括病毒載體和非病毒載體，且臨床試驗(yàn)中75％以上利用病毒為載體來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)目的基因。雖然病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但同時(shí)也存在著很多難以克服的缺點(diǎn)，如具有免疫原性、細(xì)胞毒性、缺少組織特異性等等。因此對(duì)非病毒載體的研究受到人們的重視，而目前常用的非病毒載體，如多聚陽(yáng)離子聚合物和脂質(zhì)體，也存在著轉(zhuǎn)染效率低，尤其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率低等

2、缺點(diǎn)。因此尋找新的高效、安全、靶向的非病毒載體成為目前的研究熱點(diǎn)。 隨著納米技術(shù)的興起和發(fā)展，在納米尺度內(nèi)的物質(zhì)的納米特性引起了人們的關(guān)注。納米顆粒一般是指尺寸在1～100 nm間的粒子，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的尺寸依賴性、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等特點(diǎn)，從而使其出現(xiàn)了許多不同于常規(guī)固體的新奇特性。由于納米粒子表面原子數(shù)增多，表面原子配位數(shù)不足和高的表面能，使這些原子易與其它原子相結(jié)合而穩(wěn)定下來(lái)，故方便在納米顆粒的表面結(jié)合生物

3、大分子，成為生物分子的高效載體。同時(shí)納米顆粒的小粒徑效應(yīng)，使得它們可以有效的逃避脾濾過(guò)、延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間、增強(qiáng)靶組織的累積，從而得以實(shí)現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)移。由于納米顆粒作為基因轉(zhuǎn)移載體具有如此眾多的優(yōu)越性，使其成為突破基因轉(zhuǎn)移瓶頸最有希望的工具，是當(dāng)今基因轉(zhuǎn)移和納米生物研究領(lǐng)域最熱門(mén)的課題之一。目前研究較多的陽(yáng)離子聚合物中發(fā)展最快的是樹(shù)枝狀聚合物(dendrimers)，其中又以聚酰胺一胺型樹(shù)枝狀聚合物(PAMAM dendrimers)研

4、究的最為廣泛。PAMAM作為基因載體具有很多優(yōu)勢(shì)，不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)、無(wú)遺傳毒性和細(xì)胞毒性、不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和細(xì)胞死亡、具有很高的基因轉(zhuǎn)移效率、能介導(dǎo)外源基因在宿主細(xì)胞染色體DNA中的整合，從而獲得轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)，還可以保護(hù)轉(zhuǎn)移基因不受機(jī)體血漿或組織細(xì)胞中各種補(bǔ)體以及各種酶的破壞，從而有利于目的基因在轉(zhuǎn)移進(jìn)入靶細(xì)胞后能更好、更穩(wěn)定的發(fā)揮作用。因此PAMAM作為基因載體具有廣闊的應(yīng)用前景。 【PAMAM納米載體結(jié)合和

5、保護(hù)DNA的能力】 本研究項(xiàng)目通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PAMAM dendrimers作為基因載體的可行性，并將其應(yīng)用于白血病的基因治療研究。首先制備水溶性的PAMAM dendrimers納米顆粒，原子力顯微鏡檢測(cè)顯示PAMAM直徑約8 nm±0.5 nm左右，分布均勻。作為基因載體，與DNA的結(jié)合能力是必備條件之一，應(yīng)用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和DNA共沉淀實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)PAMAM的DNA結(jié)合能力。結(jié)果顯示，該納米顆粒在pH 5～9時(shí)可以結(jié)合和

6、保護(hù)DNA，但是在pH 3時(shí)就喪失了這種能力。因此PAMAM具有在生理?xiàng)l件下(pH 7.35～7.45)對(duì)DNA的結(jié)合和保護(hù)能力。Zeta電位測(cè)定說(shuō)明PAMAM的DNA結(jié)合能力是基于一種電負(fù)性DNA磷酸骨架和PAMAM的正電性之間的靜電結(jié)合。用MTT檢測(cè)PAMAM、PAMAM/DNA復(fù)合物對(duì)不同細(xì)胞系COS7、SMF、K562和Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示在質(zhì)量比為2：1～4：1時(shí)形成的PAMAM/DNA復(fù)合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響很

7、小，但質(zhì)量比超過(guò)4：1時(shí)形成的復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的影響。 【PAMAM基因轉(zhuǎn)運(yùn)體系的體內(nèi)外研究】 以PAMAM為載體轉(zhuǎn)染編碼綠色熒光蛋白的報(bào)道基因pEGFP-C2到COS7細(xì)胞，直接在熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果證實(shí)PAMAM可以有效的攜帶外源基因在細(xì)胞中分布并表達(dá)出目的蛋白。但是，熒光素酶分析結(jié)果顯示PAMAM與目的DNA以不同比例結(jié)合時(shí)的轉(zhuǎn)染效率不同，當(dāng)PAMAM/DNA質(zhì)量比為4：1時(shí)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高。

8、掃描電子顯微鏡下直觀觀察細(xì)胞對(duì)PAMAM/DNA復(fù)合物的吞噬，結(jié)果顯示細(xì)胞可以高效吞噬PAMAM及其復(fù)合體，并在細(xì)胞的胞漿和胞核中廣泛分布，但在胞漿中的分布比胞核中要多。 為觀察攜帶外源質(zhì)粒DNA的PAMAM在體內(nèi)的分布狀況，將PAMAM/EGFP-C2復(fù)合物從BALB/c小鼠尾靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，取其各組織器官用戊二醛固定，制備組織切片在掃描電子顯微鏡下觀察PAMAM和PAMAM/DNA在體內(nèi)的組織細(xì)胞

9、分布。同時(shí)制備冰凍切片，直接在熒光顯微鏡下觀察PAMAM攜帶DNA在體內(nèi)的組織分布及表達(dá)。電鏡檢測(cè)顯示，小鼠的肝、腎、肺、脾、胰、腦、淋巴結(jié)和骨髓中有較多的PAMAM及PAMAM/DNA復(fù)合物存在，而在腸、胃、心中分布較少或沒(méi)有分布。 PAMAM可以在小鼠的腎小管中分布，說(shuō)明PAMAM可以通過(guò)腎臟排泄，不會(huì)在體內(nèi)蓄積。在小鼠的淋巴結(jié)和骨髓中也有。PAMAM的分布，說(shuō)明PAMAM可以有效的到達(dá)造血器官。組織熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，PAM

10、AM/DNA復(fù)合物在小鼠的肝、腎、肺、脾中有很強(qiáng)的熒光表達(dá)，而在心、腦、胃、腸中未檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)。 【PAMAM基因轉(zhuǎn)運(yùn)體系對(duì)白血病基因治療的研究】 PAMAM載體具備結(jié)合和保護(hù)DNA的能力、較高的轉(zhuǎn)染效率、攜帶外源基因在體內(nèi)組織的廣泛分布和表達(dá)，為其作為基因載體進(jìn)行基因治療研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在腫瘤病理標(biāo)本的獲取、對(duì)治療有直接意義的造血干/祖細(xì)胞的體外分離純化、擴(kuò)增以及骨髓移植等方面，白血病都有其在基因治療領(lǐng)域中

11、的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因而受到廣大學(xué)者的重視，以期以白血病的基因治療為突破口，開(kāi)辟人類(lèi)腫瘤治療的新天地。p16基因是一個(gè)經(jīng)典的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)p16基因缺失在多種腫瘤的細(xì)胞株中存在，占已知腫瘤細(xì)胞株的30～50％，在白血病細(xì)胞株中占25～64％，說(shuō)明p16基因異常與多種腫瘤有密切關(guān)系。LRRC4基因是我室克隆的基因，實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)LRRC4可能作為一個(gè)受體或受體激酶或粘附分子參與調(diào)控細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育

12、和腫瘤的形成。通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)p16和LRRC4基因在K562細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)。為了明確其在體內(nèi)對(duì)于引發(fā)慢性粒細(xì)胞性白血病的K562細(xì)胞是否具有治療效果，構(gòu)建了K562-SCID白血病模型，評(píng)價(jià)p16和LRRC4對(duì)于白血病基因治療的效果，并為PAMAM作為基因載體用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了更加充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)SCID小鼠經(jīng)尾靜脈注射K562細(xì)胞的方式建立人慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞異體移植SCID小鼠白血病動(dòng)物模型，以PAMAM為載體，攜

13、帶目的治療基因p16和LRRC4通過(guò)靜脈注射治療。結(jié)果表明PAMAM同時(shí)攜帶p16和LRRC4基因時(shí)能對(duì)白血病進(jìn)行有效的治療，降低外周血中原始粒細(xì)胞的比例；減輕白血病對(duì)肝、脾和骨髓的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移；使白血病小鼠的存活率延長(zhǎng)43％，其治療效果明顯。這些結(jié)果說(shuō)明，PAMAM可以攜帶目的基因到達(dá)骨髓、肝臟、脾臟以及其他組織器官，并表達(dá)出相應(yīng)的蛋白而發(fā)揮作用。LRRC4和p16基因的共同作用可以有效的抑制K562細(xì)胞在體內(nèi)的增殖，從而減緩其誘導(dǎo)的慢性

14、粒細(xì)胞性白血病的發(fā)生和發(fā)展。 綜上所述，PAMAM具有基因載體的必要條件，包括在生理?xiàng)l件下結(jié)合和保護(hù)DNA；能在體內(nèi)外被細(xì)胞吞噬，并在細(xì)胞的胞漿和胞核分布。結(jié)合報(bào)道基因系統(tǒng)證實(shí)了PAMAM可以將外源基因攜帶至肝、腎、肺、脾，并且在上述組織中表達(dá)出目的蛋白。本研究結(jié)合納米技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)，創(chuàng)新性的應(yīng)用PAMAM作為載體，評(píng)價(jià)了其攜帶p16和LRRC4抑癌基因?qū)Π籽?dòng)物模型的治療效果，充分利用了納米顆粒的優(yōu)勢(shì)，為血液系統(tǒng)疾病的