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文檔簡介
1、背景與目的:苯并[a]芘(B[a]P)是第一個被發(fā)現(xiàn)的廣泛分布于環(huán)境中的環(huán)境化學(xué)致癌物,其經(jīng)代謝激活產(chǎn)生最終致癌物anti-BPDE后才具有致癌性。MiRNA是一類數(shù)量眾多的非編碼小RNA分子,能夠通過與靶基因的3’端非翻譯區(qū)配對結(jié)合引起翻譯抑制或mRNA的降解而起到癌基因或抑癌基因的作用。本研究中,利用anti-BPDE誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化人類支氣管上皮細胞(16HBE-T)探討miRNA在化學(xué)致癌中的可能機制。使用qRT-PCR法測量mi
2、R-106a成熟體和miR-17-5p成熟體的表達水平,并進一步使用了特異的miRNA抑制劑和模擬物下調(diào)或上調(diào)惡性轉(zhuǎn)化細胞里的miR-106a或miR-17-5p活性,以此來確定其表達高低對惡性轉(zhuǎn)化細胞生物學(xué)特性的影響。
結(jié)果顯示,與對照細胞相比(16HBE-N),miR-106a和miR-17-5p在惡性轉(zhuǎn)化細胞中存在過度表達。轉(zhuǎn)染抑制劑沉默16HBE-T細胞的miR-106a或miR-17-5p后會抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細
3、胞周期阻滯和凋亡、抑制非依賴性生長。相反,轉(zhuǎn)染模擬物上調(diào)16HBE-T細胞中的miR-106a或miR-17-5p水平后細胞表現(xiàn)出完全相反的特性。此外,對miR-106a還進行了裸鼠實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射了轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑的細胞的腫瘤組生長速度明顯減緩,而注射了轉(zhuǎn)染miR-106a模擬物的細胞的腫瘤組生長速度顯著增快。這些結(jié)果表明miR-106a和miR-17-5p在化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中可能起到癌基因的作用。因此,敲除惡變細胞
4、中的miR-106a和miR-17-5p可能是一種潛在的治療方法。
方法:
1.檢測miRNA的表達
使用TaqMan MicroRNA assays試劑盒鑒定16HBE-N和16HBE-T細胞中miRNA的表達水平。
2.瞬時轉(zhuǎn)染miRNA模擬物和抑制劑
按照Lipofectamine 2000說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染。模擬物轉(zhuǎn)染組設(shè)試驗組(miR-106a mimic和
5、miR-17-5p mimic)和陰性對照組(mimic NC),抑制劑轉(zhuǎn)染組設(shè)試驗組(anti-miR-106a和anti-miR-17-5p)和陰性對照組(inhibitor NC),此外,還設(shè)置了轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000陰性對照組(Lipo-2000 NC)。轉(zhuǎn)染5小時后評價轉(zhuǎn)染效率,72小時后檢測miRNA表達水平改變情況。
3.細胞周期實驗
轉(zhuǎn)染72小時后,用PI和Rnase A
6、著色,以流式細胞儀分析細胞周期。
4.細胞增殖實驗
在96孔板里接種相同數(shù)量的16HBE-T細胞后,培養(yǎng)24小時,再分組進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后第五天用CCK-8試劑和酶標儀檢測細胞的增殖能力。
5.凋亡實驗
轉(zhuǎn)染72小時后,使用Annexin V/PI試劑盒和流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染細胞的凋亡率。
6.軟瓊脂實驗
將500個細胞重懸于1ml 0.3%低熔點
7、瓊脂糖,然后鋪到已含1ml 0.6%半固體低熔點瓊脂糖的12孔板里。低熔點瓊脂糖用含10%血清的培養(yǎng)基配置。放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周后,計算克隆數(shù)。
7.裸鼠試驗
轉(zhuǎn)染24小時后,收集轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染組細胞,用PBS重懸細胞使細胞密度為1×107個/ml,取0.2 ml皮下注射入5周齡的BALB/c裸鼠后腿內(nèi)側(cè)。成瘤后每五天測量腫瘤體積繪制生長曲線,飼養(yǎng)42天后,處死裸鼠,取出腫瘤稱重、4%甲醛固定后進行病理鑒定。<
8、br> 8.統(tǒng)計分析
各實驗組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。滿足正態(tài)分布且方差齊同的兩組間miRNA表達差異的比較,采用兩組獨立樣本的t檢驗;三組以上的比較采用方差分析,組間兩兩比較方差齊同時采用LSD-t檢驗。不滿足正態(tài)分布時采用非參數(shù)檢驗。顯著性水平a=0.05。
結(jié)果:
1.16HBE-T細胞中miR-106a和miR-17-5p過表達
1
9、6HBE-T細胞中的miR-106a成熟體和miR-17-5p成熟體表達水平分別是16HBE-N的2.9±0.2倍和2.3±0.1倍(P<0.05)。
2.1 6HBE-T細胞轉(zhuǎn)染后miRNA表達改變
與16HBE-T相比,轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑或模擬物后miR-106a表達水平分別為0.3±0.1和1.9±0.3倍(P<0.05),轉(zhuǎn)染miR-17-5p抑制劑或模擬物后miR-17-5p表達水平分別為0
10、.4±0.1和1.7±0.2倍(P<0.05)。
3.轉(zhuǎn)染后細胞周期分布改變
與inhibitor NC組比較,anti-miR-106a組和anti-miR-17-5p組均出現(xiàn)G0/G1期細胞比例增多、S期細胞比例減少(P<0.05)。與mimic NC組比較,轉(zhuǎn)染miR-106a mimic后G0/G1期細胞比例減少,S期細胞比例增多(P<0.05)。
4.轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力改變
11、 與對照組相比,轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑或模擬物后細胞的增殖能力分別降低了0.37±0.01和升高了0.45±0.07倍(P<0.05),轉(zhuǎn)染miR-17-5p抑制劑或模擬物后細胞增殖能力分別降低了0.29±0.03倍和升高了0.34±0.02倍(P<0.05)。
5.轉(zhuǎn)染后細胞凋亡率改變
抑制劑試驗組比抑制劑對照組出現(xiàn)更高的凋亡率(P<0.05),而各陰性對照組與未轉(zhuǎn)染組相比,凋亡率差別。同時,模擬物試
12、驗組與模擬物對照組相比凋亡率大幅下降(P<0.05)。
6.轉(zhuǎn)染后細胞集落形成率改變
抑制劑試驗組比抑制劑對照組和未處理組細胞出現(xiàn)更少的克隆數(shù)(P<0.05)。而模擬物試驗組與模擬物對照組相比克隆數(shù)增多(P<0.05)。
7.裸鼠實驗
在6種處理組中,anti-miR-106a組的腫瘤生長速度最慢(P<0.05),miR-106a mimic組的腫瘤生長速度最快(P<0.05),而
13、16HBE-T組、Lipo-2000 NC組、inhibitor NC組、mimic NC組的腫瘤生長速度無明顯差別。接種42天后收獲腫瘤,結(jié)果發(fā)現(xiàn),anti-miR-106a組的腫瘤平均重量(35.7±9.6mg)明顯低于inhibitor NC組的腫瘤平均重量 (110.8±15.3 mg)(P<0.05)。miR-106a mimic組的腫瘤平均重量(340.4±23.1 mg) 明顯高于mimic NC組的腫瘤平均重量(127.
14、6±21.9 mg)(P<0.05)。經(jīng)病理學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn),注射此6種細胞的小鼠均生長出鱗狀細胞癌。
結(jié)論:
1.Anti-BPDE誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細胞16HBE-T存在miR-106a和miR-17-5p成熟體表達上調(diào)。
2.miR-106a和miR-17-5p成熟體表達水平改變能夠影響16HBE-T細胞生物學(xué)特性。
3.miR-106a和miR-17-5p在環(huán)境化學(xué)致癌劑
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