Smac類似物L(fēng)CL161對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖與凋亡的影響及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的：
　　1.觀察Smac類似物L(fēng)CL161對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖的影響。
　　2.研究LCL161是否通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮對(duì)其增殖的影響。
　　3.探討LCL161誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1. MTT法檢測(cè)LCL161對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480及HT-29存活率的影響。
　　2.克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LCL161對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成的影響。
　　3. JC-1染色法檢測(cè)LCL161對(duì)結(jié)

2、腸癌SW480及HT-29細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響。
　　4. DAPI染色法檢測(cè)LCL161對(duì)人結(jié)腸癌SW480及HT-29細(xì)胞株細(xì)胞核的影響。
　　5.溴化丙啶（propidium iodide，PI）單染法檢測(cè)LCL161對(duì)結(jié)腸SW480及HT-29細(xì)胞株凋亡的影響。
　　6.電鏡觀察LCL161處理結(jié)腸癌細(xì)胞后細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的變化。
　　7.Western blot法檢測(cè)LCL161處理人結(jié)腸癌SW480及

3、HT-29細(xì)胞株對(duì)IAPs（XIAP，cIAP1/2）及TNF-α表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1 LCL161抑制人結(jié)腸癌SW480和HT-29細(xì)胞株的增殖
　　1.1MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度LCL161(0,0.2,1,5,10?mol/L)對(duì)人結(jié)腸癌SW480及HT-29細(xì)胞株均抑制細(xì)胞存活率的作用，且隨著LCL161濃度的增加和作用時(shí)間的延長，對(duì)細(xì)胞存活率的抑制逐漸增強(qiáng)，高濃度LCL161抑制作用較明顯。在濃

4、度為10μmol/L時(shí)，觀察LCL161作用24 h時(shí)細(xì)胞存活率分別為44.6％，78.6%。
　　1.2克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示LCL161可以抑制人結(jié)腸癌SW480及HT-29細(xì)胞株的克隆增殖，且隨著LCL161濃度的增加，對(duì)克隆的抑制逐漸增強(qiáng)。
　　2 LCL161誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480和HT-29細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡
　　2.1 LCL161可以降低 JC-1在線粒體膜上的紅色熒光強(qiáng)度，提高其綠色熒光強(qiáng)度，說明LCL161

5、可以降低兩株細(xì)胞的線粒體膜電位。
　　2.2 DAPI染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LCL161可導(dǎo)致兩株乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核濃染，核分裂增多，并和LCL161濃度相關(guān)，表明LCL161可引起結(jié)腸癌細(xì)胞核固縮，分裂。
　　2.3不同濃度的LCL161（0μmol/L,5μmol/L,10μmol/L）處理人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HT-2924 h后，PI單染法檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著LCL161濃度的增加，SW480和HT-29細(xì)胞的死亡率逐

6、漸增多，凋亡細(xì)胞比例分別為1.6%、30.1%、49.1%和5.8%、14.7%、26.1%。說明LCL161可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。
　　2.4透射電鏡（TEM）觀察結(jié)腸癌細(xì)胞受LCL161刺激后的亞細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果示：相比較空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組（10??mol/L）的較多結(jié)腸癌細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮，染色質(zhì)邊集，細(xì)胞核固縮及凋亡小體形成等典型凋亡形態(tài)學(xué)特征。
　　3 LCL161誘導(dǎo)cIAP1降解，促進(jìn)TNF-α合成

7、，介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡
　　3.1 Western-blot法分別檢測(cè)LCL161處理后各組結(jié)腸癌SW480和HT-29兩種細(xì)胞株細(xì)胞凋亡抑制蛋白（cIAP1、cIAP2、XIAP）的表達(dá)水平。從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以觀察出：1.隨著藥物濃度的增加，cIAP1的蛋白的表達(dá)在兩個(gè)細(xì)胞株中都存在逐漸減少的趨勢(shì)。2.同樣的方法和時(shí)間點(diǎn)，但是觀察到cIAP2、XIAP的蛋白的表達(dá)變化不明顯。
　　3.2隨著LCL161濃度增高，兩株細(xì)胞內(nèi)的

8、TNF-α在PVDF膜上顯示出條帶逐漸濃深。說明LCL161可以促進(jìn)外源性細(xì)胞凋亡通路配體TNF-α的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1 Smac類似物L(fēng)CL161能夠顯著地抑制人結(jié)腸癌SW480和HT-29細(xì)胞株的增殖能力，作為臨床治療結(jié)腸癌的新藥物具有一定的潛在研究價(jià)值。
　　2 Smac類似物L(fēng)CL161引起的人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制的可能機(jī)制是通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。
　　3 Smac類似物L(fēng)CL16