大花旋覆花內(nèi)酯抑制HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖及其機(jī)制研究.pdf

1、大花旋覆花內(nèi)酯(ABL)是從歐亞旋覆花中提取的活性單體,具有抗炎和抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及新生內(nèi)膜形成的功效,對(duì)乳腺癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞株具有促凋亡作用。但ABL是否對(duì)結(jié)腸癌具有抑制作用尚不清楚。基于炎癥是導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制之一,本研究觀(guān)察了ABL對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖和細(xì)胞周期的干預(yù)作用,并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了探討,為ABL在結(jié)腸癌治療方面的應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法和結(jié)果:
　　 1 ABL抑

2、制HT-29細(xì)胞增殖
　　 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞接種于96孔板中,分別加入不同濃度ABL作用24 h后,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示,隨著ABL濃度增加,HT-29細(xì)胞增殖活力不斷下降,ABL的抗增殖作用具有劑量依賴(lài)性。與對(duì)照組相比,不同濃度ABL(0、50、100、150、200μmol/L)處理的HT-29細(xì)胞的增殖活力分別下降了21％、38％、49％和61％。
　　 在相同處理?xiàng)l件下,用細(xì)胞計(jì)數(shù)

3、檢測(cè)增殖活性,發(fā)現(xiàn)隨著ABL濃度的增加,HT-29細(xì)胞數(shù)量不斷降低,與對(duì)照組相比,分別減少了40％、52％、64％、76％和84％,與MTT分析結(jié)果一致,表明ABL能夠劑量依賴(lài)性地抑制HT-29細(xì)胞的增殖。
　　 2 ABL對(duì)HT-29細(xì)胞周期的阻滯作用
　　 將ABL處理后的HT-29細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,預(yù)冷的70％乙醇4℃固定過(guò)夜。加熒光染料后,過(guò)濾,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果顯示,不同濃度ABL(50

4、、100、150、200μmol/L)作用HT-29細(xì)胞24h后,可使處于S期的細(xì)胞數(shù)顯著減少,而G0/G1期的細(xì)胞數(shù)增加,較對(duì)照組分別增加了3％、12％、19％和24％,表明ABL能夠劑量依賴(lài)性地抑制HT-29細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　 3 ABL抑制HT-29細(xì)胞cyclinE和CDK4的表達(dá),上調(diào)p21的表達(dá)用不同濃度ABL(0、50、100、150、200μmol/L)處理HT-29細(xì)胞24h后,用Western blot檢測(cè)

5、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,ABL可劑量依賴(lài)性地抑制cyclinE和CDK4的表達(dá)(P＜0.05),與此同時(shí),p21的表達(dá)量逐漸升高,分別是對(duì)照組的1.16、1.43、1.53和1.59倍,提示ABL阻滯HT-29細(xì)胞周期進(jìn)程與抑制cyclinE、CDK4表達(dá)及上調(diào)p21表達(dá)有關(guān)。
　　 4 ABL誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞KLF4的表達(dá)
　　 Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor,KLF4)

6、是一種含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族成員,主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡等過(guò)程,在胃腸道上皮細(xì)胞中含量豐富,在結(jié)腸癌的病理發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Western blot結(jié)果顯示,ABL可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞表達(dá)KLF4,與未處理的對(duì)照細(xì)胞比較,ABL處理24h后,KLF4表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.04、1.19、1.25和1.56倍。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,KLF4主要存在于HT-29細(xì)胞胞漿中,給予ABL(200μmol/L)刺激

7、24h后,胞漿中KLF4含量明顯增多。
　　 5 KLF4抑制HT-29細(xì)胞增殖
　　 為了確定ABL誘導(dǎo)KLF4表達(dá)與其抑制增殖之間的關(guān)系及藥理意義,進(jìn)而用重組腺病毒pAd-KLF4感染細(xì)胞48h進(jìn)行MTT分析。結(jié)果顯示,KLF4的過(guò)表達(dá)能夠抑制HT-29細(xì)胞增殖,其抑制效應(yīng)與感染病毒量(0、20、30、40和50μl/ml)呈正相關(guān),提示JLF4參與介導(dǎo)ABL的抗增殖效應(yīng)。
　　 6 KLF4抑制HT-29細(xì)

8、胞中cyclinE和CDK4的表達(dá),上調(diào)p21的表達(dá)
　　 為了揭示KLF4介導(dǎo)ABL抗增殖的機(jī)制,本研究觀(guān)察了過(guò)表達(dá)KLF4對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,Western blot分析發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)KLF4的細(xì)胞中cyclinE和CDK4表達(dá)分別下降了51％和40％,而p21的表達(dá)水平是升高的。這些數(shù)據(jù)表明,過(guò)表達(dá)KLF4可引發(fā)與ABL相似的抗腫瘤效應(yīng),表明ABL是通過(guò)激活KLF4而阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程和抑制HT-29細(xì)胞