肝細胞癌患者血漿中低豐度差異表達蛋白質(zhì)組分析.pdf

1、肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率目前有上升趨勢，在亞洲，有數(shù)量非常龐大的患者正在遭受肝細胞肝癌（HCC）、尤其是乙肝和丙肝病毒感染相關(guān)HCC的痛苦。HCC侵襲性極強，預(yù)后差，因此，早期診斷、早期治療對肝癌尤其重要。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是臨床上診斷HCC最常用的腫瘤標志物之一，但敏感性較低（70％左右），特異性也較低（64％），單獨應(yīng)用A

2、FP診斷HCC容易造成漏診和誤診。因此，從血漿/血清中尋找新的HCC早期診斷指標物是HCC相關(guān)研究的一大熱點。 本文在已有工作的基礎(chǔ)上，以5例肝細胞肝癌（HCC）患者血漿為研究對象，選用免疫親和色譜去除血漿中六種主要高豐度蛋白、離線反相液相色譜法預(yù)分級血漿低豐度蛋白并收集差異表達蛋白組；通過二維納流液相色譜芯片富集、分離酶解肽混合物，線性離子阱質(zhì)譜途徑在線鑒定差異蛋白，為從血漿中篩選診斷HCC的新穎標志物提供了可行的技術(shù)路線。

3、 一、樣本收集與處理 為了研究工作具有可比性，按照HUPO（Human Proteome Organization）推薦的選取健康志愿者標準與收集處理標準選擇和處理正常對照組和肝細胞肝癌患者組血漿標本。 二、血漿中高豐度蛋白的去除 血漿蛋白質(zhì)組學面臨的首要瓶頸問題之一是血漿高豐度蛋白的去除。研究工作選用曾在HUPO PPP（Plasma Proteome Project）項目中廣泛使用的多重親和去除系統(tǒng)[M

4、ARS（Agilent Mutiple Affinity RemoveSystem）Spin Cartridge]去除血漿中六種主要高豐度蛋白（白蛋白、結(jié)合珠蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、轉(zhuǎn)鐵蛋白、α-1-抗胰蛋白酶），并用Amicon Ultra-4（3 kDa）濃縮得到血漿低豐度蛋白質(zhì)組。 在去除HCC血漿中高豐度蛋白質(zhì)組前，用一維聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）驗證了MARS Spin Cartridge去除正常

5、對照血漿高豐度蛋白的效果。 對健康志愿者混合血漿和5例HCC患者血漿中MARS柱結(jié)合的高豐度蛋白和流出的低豐度蛋白Bradford法定量結(jié)果表明該方法可有效去除血漿高豐度蛋白，去除率為85％，重復(fù)性好。 三、血漿低豐度蛋白質(zhì)組預(yù)分級 考慮到疏水性蛋白質(zhì)在生物標志物中的重要性，研究工作采用反相高效液相色譜（Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography，R

6、P-HPLC）對血漿低豐度蛋白質(zhì)組進行預(yù)分級，包括：①以正常對照血漿低豐度蛋白組為樣本考察并優(yōu)化樣本的前處理、反相色譜條件和手動收集色譜峰延遲時間；②按照優(yōu)化的分離條件對正常對照血漿、HCC患者血漿低豐度蛋白組進行預(yù)分級，收集HCC血漿樣本差異表達色譜峰。 研究工作表明，與健康志愿者混合血漿低豐度蛋白質(zhì)組的分級結(jié)果比較，HCC患者血漿低豐度蛋白質(zhì)組中出現(xiàn)了共同高表達的色譜差異峰B，共同低表達差異峰C；1＃HCC患者血漿低豐度蛋白

7、質(zhì)組中出現(xiàn)了特有高表達色譜峰A。 四、二維納流液相色譜芯片/離子阱質(zhì)譜分析 分別對研究中選擇的1號HCC患者血漿低豐度蛋白質(zhì)組中共同高表達色譜差異峰B、特有高表達色譜峰A進行了進一步的二維液相色譜-芯片離子阱質(zhì)譜分離與分析。 差異表達蛋白組經(jīng)離線胰酶酶解后，采用二維液相色譜-芯片（HPLC-Chip，包含一支納升級Zorbax300SB-C18富集柱和一支納升級Zorbax300SB-C18分析柱）富集、分離肽混

8、合物，線性離子阱質(zhì)譜在線分析，以Spectrum Mill MS Proteomics Workbench自動分析MS和MS/MS數(shù)據(jù)后在UniProtKB/SWISS-PORT數(shù)據(jù)庫中進行搜索，鑒定得到27種差異蛋白，其中23種蛋白與各種疾病或腫瘤相關(guān)，IMP3（Insulin-like growth factor2 mRNA-binding protein3）、ARNT2（Aryl hydrocarbon receptor nucl