IBV S1蛋白結(jié)合組織細(xì)胞膜蛋白和干擾CEK細(xì)胞感染作用.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病，一直是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的最重要的疫病之一。目前常見IB的臨床型是呼吸型和腎型，且之間免疫原性差異較大，致使現(xiàn)有疫苗免疫效果不夠理想。
　　 IBV有3個主要結(jié)構(gòu)蛋白：S蛋白、M蛋白和N蛋白。S蛋白是IB

2、V非常重要的一個結(jié)構(gòu)蛋白，轉(zhuǎn)譯后分為S1和S2糖蛋白。IBV的S1蛋白一直被認(rèn)為能激發(fā)中和抗體和血凝抑制抗體，并與病毒的組織嗜性有關(guān)。S蛋白與宿主細(xì)胞膜上的受體結(jié)合可能是IBV吸附細(xì)胞的前提條件，S1基因的變異，將直接影響到病毒與細(xì)胞膜受體的結(jié)合。本研究主要對IBV典型毒株呼吸型M41株和腎型Holte株的S1基因利用昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)進行了重組表達，試對其的免疫原性、組織膜蛋白親嗜性及其與宿主細(xì)胞黏附情況進行比較分析。
　　 本

3、試驗主要的研究內(nèi)容、方法和結(jié)果如下：
　　 1.根據(jù)GenBank中已發(fā)布的IBV S1基因，設(shè)計并合成了1對特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)擴增S1基因，并進行克隆和測序。本試驗擴增出的S1基因所用的病毒是將本實驗室保存IBV M41株和Holte株在CEK細(xì)胞盲傳三代后又在SPF雞胚中繁殖七代的雞胚尿囊液病毒。測序結(jié)果表明，IBV M41和Holte株所克隆的S1基因片段大小分別為1655 bp和1654 bp。序列比較分析

4、，克隆的IBV M41-S1基因與GenBank中已發(fā)布的M41株S1基因核苷酸同源性為99.52％，氨基酸同源性為99.3%；IBV Holte-S1基因與GenBank中已發(fā)布的Holte株S1基因核苷酸同源性為99.76%，氨基酸同源性為99.69%；兩種毒株S1基因核苷酸同源性為81.61%，氨基酸同源性為89.86%。
　　 2.本試驗利用Bac-to-Bac真核表達系統(tǒng)構(gòu)建了表達兩株S1蛋白的重組桿狀病毒。將兩株重組

5、桿狀病毒分別感染Sf9細(xì)胞后，用IFA、SDS-PAGE和Western blot等方法檢測Sf9細(xì)胞中蛋白的表達。經(jīng)檢測，在Sf9細(xì)胞中得到了IBV M41株和Holte株的S1蛋白，蛋白分子量約為64 ku。通過分子量大小可知，得到兩株病毒的S1蛋白糖基化均不完全，但仍然具有抗原活性。
　　 3.將IBVM41株和Holte株重組S1蛋白的細(xì)胞裂解液與等體積弗氏完全佐劑充分融合后，分別對1日齡的SPF雛雞進行免疫，采集免疫后

6、的血清，利用SPF雞胚進行病毒-血清交叉中和試驗。試驗結(jié)果表明，本試驗表達的兩株S1蛋白可以誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生并有良好的免疫保護力，兩株S1蛋白的免疫血清也有一定程度的交叉保護能力。
　　 4.本試驗首次利用間接ELISA方法驗證S1蛋白與不同組織細(xì)胞膜蛋白結(jié)合情況，初步推斷其在體外與各組織細(xì)胞膜蛋白的親嗜性。用提取的4日齡SPF雛雞的氣管、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、腺胃、十二指腸、法氏囊、胸腺和脾臟等組織細(xì)胞膜蛋白包被，用純化的S1蛋

7、白與其作用，再用IBV陽性血清與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG檢測結(jié)合情況。兩株S1蛋白分別與肺臟膜蛋白結(jié)合差異均極顯著，M41株S1蛋白的結(jié)合能力高于Holte株；與腎臟、氣管和腺胃膜蛋白結(jié)合差異顯著，其中Holte株S1蛋白與腎臟及腺胃膜蛋白結(jié)合能力高于M41株，而M41株S1蛋白與氣管膜蛋白的結(jié)合能力高于Holte株；兩毒株S1蛋白與法氏囊、肝臟、脾臟、十二指腸、胸腺及心臟膜蛋白結(jié)合差異不顯著。這說明不同致病性IBV毒株與各組織細(xì)胞膜蛋

8、白的結(jié)合力存在差異，且該差異可能與IBV的組織嗜性變化有關(guān)。
　　 5.為研究S1蛋白對宿主細(xì)胞的黏附和/或封閉能力，本試驗將純化的S1蛋白與CEK細(xì)胞作用后觀察IBV對CEK細(xì)胞的影響。IBV M41-S1蛋白和IBV Holte-S1蛋白濃度均按0.5μg、0.75μ9和1μ9對CEK細(xì)胞進行處理后再加入IBV觀察細(xì)胞病變情況。按Reed-Muench兩氏法計算得出，IBV M41株和Holte株對CEK細(xì)胞的TCID50分

9、別為10-4.423/0.1 mL和10-5.234/0.1 mL；IBV M41株對處理后的CEK細(xì)胞的TCID50分別為10-3.222/0.1 mL、10-2.5/0.1 mL和10-2.233/0.1 mL；IBV Holte株對處理后的CEK細(xì)胞的TCID50分別為10-3.783/0.1 mL、10-2.738/0.1 mL和10-2/0.1 mL。結(jié)果表明，經(jīng)S1蛋白處理的CEK細(xì)胞獲得了抵抗IBV感染的能力，與未經(jīng)處理的