雙鹵西林酰胺類衍生物的設(shè)計、合成及免疫抑制活性的初步研究.pdf

1、近年來，隨著自身性免疫疾病患者以及器官移植手術(shù)對免疫抑制劑需求量的增多，急需一種低毒高效且易生產(chǎn)的新型藥物出現(xiàn)。免疫抑制劑用于臨床治療免疫性疾病已經(jīng)多年，可是目前臨床上各種免疫抑制劑的毒副作用都比較嚴重，并且與有效治療劑量非常地接近。雷帕霉素（Rapamycin）作為當前最有治療效果的免疫抑制劑，同時也是最早發(fā)現(xiàn)的一類mTOR抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路和免疫有著密切的關(guān)系，mTOR抑制劑主要通過減少T細胞中細胞因子受體的mRNA合

2、成從而阻斷其信號傳導，如白介素IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、CSF、PDGF和IGF,阻斷T細胞由G1期至S期，進而發(fā)揮免疫抑制作用。但是雷帕霉素的水溶性差、合成成本高、生物利用率低（<15％），因此本研究把目光轉(zhuǎn)向能夠克服以上缺點的小分子mTOR抑制劑上。本研究前期利用計算機輔助藥物設(shè)計手段（CADD），利用虛擬篩選方法以mTOR蛋白為受體得到雙鹵西林酰胺先導化合物；隨后運用逆向分析全合成的方法，合成出具有免疫抑制

3、活性的一系列雙鹵西林酰胺類衍生物。隨后通過體內(nèi)外生物活性實驗證明了藥物設(shè)計的合理性，并篩選出一種高活性的mTOR免疫抑制劑。最后結(jié)合反向?qū)优c藥效團模型為下一步獲得高效低毒的臨床免疫抑制劑提供了科學的理論基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴運用Sybyl2.0X，配體分子從ZINC和PubMed數(shù)據(jù)庫中下載，以mTOR作為受體和近200萬個小分子進行虛擬篩選，最終得到先導化合物。⑵采用分子對接方法模擬先導化合物在 mTOR受體中的作

4、用模式，分析化學結(jié)構(gòu)和生物活性的潛在關(guān)系，設(shè)計新的雙鹵西林酰胺類衍生物。⑶這個過程使用逆向全合成方法，根據(jù)最科學的合成方案得到一系列雙鹵西林酰胺類衍生物。通過核磁共振氫譜/碳譜（1H-NMR/13C-NMR）以及液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)，鑒定其結(jié)構(gòu)。⑷體外活性：基于CCK-8技術(shù)，測定所合成的化合物對于T淋巴細胞系的急性白血病細胞Jurkat的體外抑制活性，篩選出活性最高的化合物做體內(nèi)實驗；利用Western blotting方法檢測

5、經(jīng)小分子抑制劑處理后細胞蛋白水平的表達。體內(nèi)活性：用ΔLM-OVA標記的李斯特菌使 C57B1/6小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答后，給小鼠通過灌胃方式服用上述化合物。7天之后，取小鼠尾靜脈外周血并分離 T淋巴細胞，通過流式細胞術(shù)檢測 CD8+IFN-γ+T細胞占整個淋巴細胞的比例，以此鑒定化合物的體內(nèi)生物活性。⑸利用在線免費網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器Pharm Mapper讓配體化合物與7000多種蛋白受體相互作用，反釣出靶點蛋白以此預測目標分子的毒副作用。⑹

6、收集9種雙鹵西林酰胺類衍生物的化學結(jié)構(gòu)和體外生物活性數(shù)據(jù)，以此構(gòu)建一個藥效團模型，并基于藥效團模型進行3D-QSAR分析。
　　本研究表明：①虛擬篩選確定了3-(2,6-二氯苯基)-5-甲基-N-2-(6-甲磺酰苯并噻唑基)異惡唑-4-甲酰胺為先導化合物。逆向全合成方法以2,6-二氯苯甲醛為原料通過6步反應(yīng)，得到了9個目標化合物。質(zhì)譜數(shù)據(jù)與高效液相色譜數(shù)據(jù)鑒定發(fā)現(xiàn)純度都達到99%以上，與核磁共振氫譜/碳譜（1H-NMR/13C-N

7、MR）數(shù)據(jù)均與目標化合物一致。②體外檢測藥物對細胞增值抑制效應(yīng)為Cell Counting Kit-8法，運用的細胞為Jurkat T淋巴細胞，將測試OD值轉(zhuǎn)化為可靠有效的活性數(shù)據(jù)，驗證了雙鹵西林酰胺類衍生物對Jurkat T淋巴細胞的增值抑制作用。經(jīng)Western blotting方法檢測這類化合物的確可以抑制p-mTOR、以及下游蛋白4EBP1、P70S6K。③細胞流式檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)給藥小鼠特異性的 CD8+IFN-γ+T淋巴細胞比