臍帶間充質(zhì)干細胞治療急性肺損傷模型的機制探討.pdf

1、第一部分.UC-MSCs對ALI模型的治療作用
　　目的：完善UC-MSCs胚胎干性相關(guān)基因檢測；建立脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的C57BL/6和BALB/C兩種遺傳背景的急性肺損傷（ALI）模型，觀察UC-MSCs對不同背景小鼠ALI的治療作用，證實UC-MSCs治療LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷療效具有普遍性。
　　方法：用熒光定量PCR方法檢測 UC-MSCs胚胎干性相關(guān)基因OCT-4、SOX-2、NANOG、SSEA-4的表達；將

2、 C57BL/6小鼠分別隨機分成3組：Ctrl空白對照組(PBS+PBS)、ALI組(LPS+PBS)、ALI+UC-MSCs治療組(LPS+UC-MSCs)，每組24只；BALB/C小鼠分組和處理方法相同。腹腔麻醉后行氣管插管術(shù)，Ctrl組給予30μl PBS，ALI組和ALI+UC-MSCs組分別給予30μl LPS(5mg/kg)。1h后ALI+UC-MSCs組給予80μl新鮮制備的UC-MSCs細胞懸液（細胞數(shù)量0.5x106）

3、。Ctrl組和ALI組分別給予PBS（80μl）。觀測各組小鼠體重和生存率的變化，24h、72h、120h處死老鼠收集標本，HE染色檢測肺組織病理改變，檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中細胞總數(shù)及其分類計數(shù)、總蛋白濃度和MPO活性。
　　結(jié)果：UC-MSCs中胚胎干性相關(guān)基因SSEA-4表達量較高，達到胚胎干細胞表達量的1/4，但是UC-MSCs基本不表達其他胚胎干性相關(guān)基因OCT-4、SOX-2、NANOG。經(jīng)氣管插管術(shù)給予

4、LPS構(gòu)建C57BL/6背景的ALI模型，與Ctrl組相比，病理染色結(jié)果顯示大量炎癥細胞浸潤、肺出血、肺泡間隔增厚，表明C57BL/6ALI模型構(gòu)建成功。UC-MSCs治療后，C57BL/6ALI和BALB/C ALI兩種小鼠的體重和生存率都明顯提高（p<0.05）。UC-MSCs治療C57BL/6 ALI模型24h、72h、120h后，小鼠肺組織炎癥明顯下降，肺病理損傷明顯降低，BALF中細胞總數(shù)和中性粒細胞分類計數(shù)、總蛋白濃度和MP

5、O活性明顯減低（p<0.05）
　　結(jié)論：胚胎干性相關(guān)基因SSEA-4在維持UC-MSCs干性中具有重要意義。UC-MSCs對BALB/C和C57BL/6不同遺傳背景的ALI小鼠都有很好的治療效果，證實了UC-MSCs治療ALI的普遍性，為其臨床研究和治療ALI提供了新的證據(jù)。
　　第二部分.UC-MSCs對ALI模型免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用
　　目的：探究UC-MSCs對ALI模型體內(nèi)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，明確UC-MSCs

6、治療ALI的細胞分子機制。
　　方法：用蛋白芯片檢測UC-MSCs治療后ALI小鼠BALF中308種蛋白表達量的變化。通過GO-term和KEEG-Pathway分析這些差異性蛋白的生物學(xué)功能，揭示UC-MSCs是否具有調(diào)節(jié)ALI小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)的作用，并篩選與其有關(guān)的具體免疫細胞。采用熒光定量PCR和ELISA驗證蛋白芯片的結(jié)果。流式細胞術(shù)檢測UC-MSCs治療后ALI小鼠肺泡巨噬細胞數(shù)量和胞內(nèi)IL-10表達量的改變；體外細胞實

7、驗用UC-MSCs干預(yù)LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥模型，觀察巨噬細胞形態(tài)變化以及ELISA檢測其TNF-α、IL-10表達變化。
　　結(jié)果：蛋白芯片結(jié)果顯示UC-MSCs治療72h后ALI小鼠BALF中22種蛋白明顯降低和8種明顯升高。GO-term和KEEG-pathway分析發(fā)現(xiàn)這些差異性蛋白的主要的生物學(xué)功能與免疫反應(yīng)相關(guān)，其中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、CCL17和CCL22與肺泡巨噬細胞免疫功能密切相關(guān)。P

8、CR和ELISA檢測結(jié)果顯示UC-MSCs治療后，ALI小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6明顯下降,IL-10、CCL17和CCL22明顯升高（p<0.05）。體內(nèi)流式細胞術(shù)結(jié)果顯示UC-MSCs治療后ALI小鼠肺泡巨噬細胞數(shù)量減少,但是其胞內(nèi)IL-10的表達增加（p<0.05）。體外實驗結(jié)果顯示UC-MSCs干預(yù)72h后，經(jīng) LPS刺激的巨噬細胞觸突的數(shù)量減小，ELISA檢測TNF-α表達下降和IL-10表達升高（p<0.

9、05）。
　　結(jié)論：UC-MSCs治療可有效調(diào)節(jié)ALI小鼠體內(nèi)肺泡巨噬細胞的功能，抑制LPS刺激后肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)的同時，促進其分泌更多的IL-10，對后續(xù)UC-MSCs治療作用的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　第三部分.UC-MSCs治療ALI模型的旁分泌及分子機制
　　目的：明確UC-MSCs旁分泌對 ALI模型的治療作用，并探討其具體分子機制。
　　方法：BABL/C小鼠隨機分ALI、ALI+CM(UC-MSC

10、s)、ALI+CM（Fibroblast）3組，每組24只。在LPS建模1h后, ALI+CM(UC-MSCs)組、ALI+CM（Fibroblast）組分別給予80μl UC-MSCs和Fibroblast的濃縮條件培養(yǎng)基，ALI組給予80ulPBS，觀察各組小鼠體重、生存率變化，24h、72h、120h處死小鼠收集標本，HE染色檢測肺組織病理變化。ELISA檢測UC-MSCs與LPS刺激后的巨噬細胞共培養(yǎng)中UC-MSCs分泌的PGE

11、2、IL-4、IL-13的表達量。體外實驗用PGE2合成關(guān)鍵酶特異性抑制劑Celecoxib干預(yù)UC-MSCs后收集細胞及其上清，分別與LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥模型共培養(yǎng)72h，檢測巨噬細胞TNF-α和IL-10的表達。體內(nèi)實驗將小鼠隨機分為Ctrl、ALI、ALI+UC-MSCs、ALI+UC-MSCs(-PGE2)、ALI+CM、ALI+CM（-PGE2）6組，每組24只。LPS建模1h后ALI+UC-MSCs組和ALI+CM組分別

12、給予未經(jīng)Celecoxib處理的80μl UC-MSCs細胞懸液(細胞數(shù)量0.5x106）和濃縮條件培養(yǎng)基，ALI+UC-MSCs(-PGE2)組和ALI+CM（-PGE2）組分別給予80μl經(jīng)Celecoxib處理的UC-MSCs細胞懸液(細胞數(shù)量0.5x106）和濃縮條件培養(yǎng)基，Ctrl、ALI給予80μl PBS。觀察各組體重、生存率變化，在72h處死老鼠收集標本，HE染色檢測肺組織病理改變，ELISA檢測BALF中TNF-α和I

13、L-10表達變化。
　　結(jié)果：UC-MSCs的條件培養(yǎng)基能夠有效保護ALI模型小鼠，與ALI組比較，ALI+CM(UC-MSCs)組小鼠的體重和生存率明顯提高，肺病理損傷明顯降低（p<0.05）；體外細胞實驗檢測UC-MSCs與LPS的刺激巨噬細胞共培養(yǎng)72h后，UC-MSCs表達的PGE2明顯升高（p<0.05），而IL-4、IL-13表達量沒有改變。體外細胞實驗 PGE2被Celecoxib干預(yù)后，UC-MSCs及其條件培養(yǎng)基

14、對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用都明顯下降，分別與Mac+LPS+UC-MSCs組和Mac+LPS+CM組比較，Mac+LPS+UC-MSCs(-PGE2)組和Mac+LPS+CM（-PGE2）組中巨噬細胞TNF-α表達升高和IL-10表達降低（p<0.05）。體內(nèi)細胞實驗PGE2被Celecoxib干預(yù)后，UC-MSCs及其條件培養(yǎng)基對ALI小鼠的保護作用都明顯下降，分別與ALI+UC-MSCs組和ALI+CM組相比較，ALI