臍帶間充質(zhì)干細胞及氣體治療急性肺損傷的實驗研究.pdf

1、ALI/ARDS在20世紀60年代首次被公認為一種臨床綜合癥，表現(xiàn)為低氧血癥、雙肺浸潤的嚴重急性呼吸衰竭。引起ALI/ARDS的病因復(fù)雜，其中彌漫性肺部感染特別是革蘭氏陰性桿菌感染為最主要原因，而內(nèi)毒素(LPS)正是革蘭氏陰性桿菌感染的主要致病因素。ALI/ARDS當前的治療方案主要是支持治療，給予肺保護性通氣以及藥物保守治療，而迄今為止的臨床試驗所評價的大批治療藥物并沒有哪一種被證實是有效的，ALI/ARDS的死亡率仍高達40％。因此

2、，創(chuàng)新的治療手段對于ALI/ARDS是十分必要的。
　　干細胞目前已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stemcells，MSC)因為其良好的安全性，目前已經(jīng)成為臨床研究和應(yīng)用的主要細胞來源。因此，本研究首先構(gòu)建內(nèi)毒素誘導的急性肺損傷模型，并獲取人臍帶來源的間充質(zhì)干細胞，擬探討人臍帶間充質(zhì)干細胞對內(nèi)毒素誘導的急性肺損傷的治療作用、實際應(yīng)用研究、與臨床常用藥物的治療比較以及可能的治療機理。
　　因此

3、，我們制定了如下的實驗內(nèi)容及方法:一、構(gòu)建內(nèi)毒素誘導急性肺損傷模型:8-10周齡雌性C57BL/6小鼠，經(jīng)氣管內(nèi)給予LPS10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg劑量，分別觀察不同劑量下死亡率及肺部病理損傷。二、獲取無異種蛋白可臨床級應(yīng)用的人臍帶來源的間充質(zhì)干細胞:取新鮮臍帶組織，清洗、消化獲得間充質(zhì)干細胞，用無血清培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng)，經(jīng)傳代擴增后進行表面標記鑒定及分化鑒定，獲得符合間充質(zhì)干細胞生物特性的細胞。三、

4、人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-M SC)治療急性肺損傷的應(yīng)用及與甲強龍的治療比較:1.小鼠內(nèi)毒素誘導急性肺損傷模型造模成功后，給予小鼠尾靜脈移植hUC-MSC2×105，通過不同移植時間(0.5h、4h、24h)確定細胞移植有效時間窗。2.給予半數(shù)致死劑量LPS誘導小鼠內(nèi)毒素急性肺損傷模型，隨后給予小鼠不同劑量hUC-MSC(2×105、5×105、1×106)尾靜脈移植，以得出最佳細胞移植劑量。3.hUC-MSC與甲強龍治療急性肺損傷的

5、比較研究:通過病理損傷（損傷評分）、肺組織濕干重比(W/D)、BALF中總細胞數(shù)及中性粒細胞數(shù)、BALF總蛋白含量（BCA法）、BALF細胞因子含量（CBA法）、全肺細胞組分流式分析等指標比較細胞與藥物治療的效果。
　　經(jīng)過實驗我們成功構(gòu)建了氣管內(nèi)注射LPS誘導的急性肺損傷模型，模型建立容易，肺損傷程度穩(wěn)定，符合臨床上感染性急性肺損傷的病理生理改變。通過給予LPS劑量的增加，小鼠死亡率及肺部病理損傷評分均相應(yīng)增加，且數(shù)值穩(wěn)定、均一

6、，由此可根據(jù)對動物死亡率及肺部病理損傷程度的不同要求設(shè)計相應(yīng)實驗。
　　我們的實驗結(jié)果提示，膠原酶消化獲得hUC-MSC單個細胞，通過人間充質(zhì)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)原代后，細胞數(shù)量得到倍數(shù)擴增，并經(jīng)多次傳代后，細胞純度提高，形態(tài)穩(wěn)定均一，仍具有MSC典型成纖維樣、長梭形、旋渦狀生長特點及無限擴增能力。培養(yǎng)至P4代細胞表面不同特異抗原仍具有穩(wěn)定表達，高表達MSC細胞特異標志CD44、CD73、CD90、CD105及HLA-ABC，不表達造

7、血細胞表面標志CD14、CD34、CD45及不表達內(nèi)皮細胞標志HLA-DR。通過體外特異培養(yǎng)基誘導hUC-MSC分化成骨、成脂，結(jié)果提示我們的hUC-MSC在P4代仍具有較強的分化能力。從形態(tài)、表面標志抗原及分化能力等不同結(jié)果分析，實驗獲得的hUC-MSC具有成體間充質(zhì)干細胞生物學特性。
　　進一步研究我們發(fā)現(xiàn)，小鼠內(nèi)毒素誘導急性肺損傷模型造模成功后，分別于0.5h、4h、24h給予2×105 hUC-MSC尾靜脈移植，48h后觀

8、察實驗動物病理損傷程度。結(jié)果顯示在致傷后0.5小時、4小時及24小時給予人臍帶間充質(zhì)干細胞2×105尾靜脈移植治療均可減輕內(nèi)毒素誘導的肺組織病理損傷，說明致傷后0.5h-24h均為有效治療時間。
　　而當給予半數(shù)致死劑量LPS造模后，分別給予PBS以及不同劑量hUC-MSC(2×105、5×105、1×106)尾靜脈移植，48h后觀察實驗動物死亡率及病理損傷程度。實驗結(jié)果顯示在同等造模劑量并同時給予細胞移植情況下，hUC-MSC2

9、×105劑量下對于小鼠有保護作用，肺部組織病理損傷明顯減輕，小鼠死亡率降低，對于急性肺損傷有明顯的治療效果，而隨著hUC-MSC移植劑量的增大，保護效果逐漸減弱，病理損傷評分增加，甚至增加了死亡率。
　　小鼠內(nèi)毒素誘導急性肺損傷模型造模成功后，于造模后24h分別給予PBS、hUC-MSC、甲強龍(Drug)、hUC-MSC+甲強龍(hUC-MSC+Drug)尾靜脈移植治療。48h后觀察實驗動物病理損傷程度，可見小鼠致傷后給予hUC

10、-MSC、甲強龍以及hUC-MSC與甲強龍聯(lián)合治療均有效減輕了肺組織病理損傷。從損傷評分來看，hUCMSC與甲強龍聯(lián)合治療效果最好，損傷評分最低，但是與單獨應(yīng)用hUCMSC或甲強龍組比較并無統(tǒng)計學差異，其效果并未優(yōu)于其他兩組。
　　小鼠致傷后給予hUC-MSC、甲強龍以及hUC-MSC與甲強龍聯(lián)合治療，各治療組肺組織濕干重比均較PBS對照組有所下降，hUC-MSC組與聯(lián)合治療組均有顯著差異，甲強龍治療組濕干重比與PBS對照組比略低

11、，但未達到統(tǒng)計學差異。
　　小鼠內(nèi)毒素誘導急性肺損傷后給予hUC-MSC、甲強龍以及hUC-MSC與甲強龍聯(lián)合治療，與PBS對照組相比，各治療組BALF細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比及中性粒細胞數(shù)均明顯下降，有顯著性差異，說明各組治療均可減輕內(nèi)毒素誘導急性肺損傷的炎癥反應(yīng)。各治療組BALF中總蛋白含量明顯降低，其中甲強龍+hUC-MSC組總蛋白含量最低，hUC-MSC組次之，甲強龍組略高，但三組之間比較無統(tǒng)計學差異。
　　肺損傷

12、后給予hUC-MSC、甲強龍、甲強龍+hUC-MSC各組治療后，BALF中TNF、IL-6含量明顯降低，IFN-γ、IL-10、MCP-1、IL-12無明顯變化，在三組治療中，聯(lián)合治療組并未比單獨應(yīng)用hUC-MSC或甲強龍在炎癥因子調(diào)節(jié)方面取得更好效果。
　　肺損傷后給予PBS、hUC-MSC、甲強龍治療，觀察2d、7d、14d、28d各時間點CD45-CD31+細胞群（內(nèi)皮細胞）、CD45+細胞群（白細胞）、CD31-CD45-

13、EpCAM+細胞群（上皮細胞）、CD31-CD45-EpCAMScal+細胞群（間質(zhì)細胞）、CD31-CD45-CD24lowEpCAMhi細胞群（上皮干祖細胞）各群細胞組分變化。結(jié)果表明，與PBS組比較，2d時甲強龍組CD45+細胞群（白細胞）顯著減少，而hUC-MSC組并不引起任何細胞組分變化;除CD45+群細胞外，其他各群細胞均無明顯改變，且7d、14d、28d各治療組各群細胞亦區(qū)別不大，由此考慮藥物治療的部分機制為通過降低了CD

14、45+細胞群（白細胞）而減輕炎癥反應(yīng)，而hUC-MSC的治療則并非通過改變細胞組分而起效。
　　基于以上動物模型及實驗方法，除了主要進行的hUC-MSC治療急性肺損傷的研究外，同時還與天津醫(yī)科大學謝克亮博士共同進行了NO和H2治療急性肺損傷的部分研究。
　　由此我們得出如下結(jié)論:
　　一、成功構(gòu)建了穩(wěn)定的小鼠內(nèi)毒素急性肺損傷模型
　　二、成功獲得了無異種蛋白的人臍帶來源間充質(zhì)干細胞，大大降低了細胞免疫原性，對未來

15、臨床及組織工程等多方面應(yīng)用提供了更有利的基礎(chǔ)及安全保障。
　　三、1.從臨床實際應(yīng)用出發(fā)，摸索了急性肺損傷的有效治療時間窗及最佳細胞移植劑量，在內(nèi)毒素急性肺損傷的治療方面目前尚無同類研究;
　　2.在內(nèi)毒素誘導急性肺損傷的治療相關(guān)研究中，明確了人臍帶間充質(zhì)干細胞治療急性肺損傷有顯著效果，并首次將細胞治療與目前臨床常用藥物甲強龍做比較，二者治療急性肺損傷均有顯著療效，但療效比較并無差異，且二者聯(lián)用并無協(xié)同作用，此方面研究目前尚