骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對退變軟骨的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)對大鼠退變軟骨細(xì)胞和大鼠骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　第一部體外研究
　　取Sprague-Dwley(SD)大鼠骨髓，分離單核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)。利用油紅O、茜素紅、番紅O染色檢測定向誘導(dǎo)誘導(dǎo)效果。同時(shí)利用流式細(xì)胞

2、儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45、CD90、CD105的表達(dá)。取第3代細(xì)胞備用。
　　分離培養(yǎng)SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，將第2代軟骨細(xì)胞用IL-1β(10ng/mL)誘導(dǎo)24h后，加入正常培養(yǎng)基繼續(xù)分別培養(yǎng)3，6，12天，上述不同時(shí)間點(diǎn)收集RNA和胞漿蛋白，采用RT-PCR及Western-blot法檢測Ⅱ型膠原(Col2)和蛋白多糖(aggrecan)的基因和蛋白表達(dá)。另外分別培養(yǎng)1，2，4天，收集RNA和胞漿蛋白來檢測環(huán)氧合

3、酶-2（COX-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)。同時(shí)，用含0.5％的FBS培養(yǎng)基饑餓處理后，將含有濃度為10 ng/mL IL-1β的上述培養(yǎng)基分別培養(yǎng)15 min，30min和60min，提取胞漿蛋白，采用Western-blot法檢測ERK1/2，JNK，P38，IκBα，NF-κB p65。
　　第3代BMSCs種植在0.4-μrn孔徑的Transwell膜上，第2代軟骨細(xì)胞種植在六孔板底部。IL-1β誘導(dǎo)后，收集

4、和BMSCs共培養(yǎng)3天的軟骨細(xì)胞檢測Col2和aggrecan蛋白和基因的表達(dá)，同時(shí)收集和BMSCs共培養(yǎng)1天的軟骨細(xì)胞檢測COX-2和MMP-13蛋白和基因的表達(dá)。另外，將BMSCs與IL-1β誘導(dǎo)后的退變軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)的培養(yǎng)基作為BMSCs-conditioned培養(yǎng)基。將IL-1β誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞用BMSCs-conditioned培養(yǎng)基3ml培養(yǎng)15 min后，提取胞漿蛋白檢測IκBα和NF-κB p65。培養(yǎng)30min

5、后檢測軟骨細(xì)胞胞漿內(nèi)的ERK1/2，JNK,P38。
　　第二部體內(nèi)研究
　　36只體重300-325 g的雄性SD大鼠隨機(jī)平均分為三組:PBS治療組、BMSCs治療組和假手術(shù)組。將PBS治療組和BMSCs治療組共24只大鼠切除右膝前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板，假手術(shù)組中的動(dòng)物右膝采取同上面兩組相同的髕韌帶內(nèi)側(cè)縱行0.5cm的切口并切開關(guān)節(jié)囊。術(shù)后允許所有大鼠在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下自由運(yùn)動(dòng)，連續(xù)8周。術(shù)后8周，BMSCs治療組大鼠接受關(guān)

6、節(jié)腔內(nèi)注射0.3毫升異體BMSCs（約5.0×105），而PBS治療組和假手術(shù)組則只注射等體積的PBS溶液。術(shù)后14周處死所有大鼠，我們對每組膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)髁進(jìn)行大體觀察，并根據(jù)國際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)(ICRS)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行軟骨損傷程度的評價(jià)，同時(shí)對股骨內(nèi)髁負(fù)重區(qū)骨軟骨行HE染色，并根據(jù)改良Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)對OA程度進(jìn)行組織學(xué)評價(jià)，同時(shí)進(jìn)行番紅O和甲苯胺藍(lán)染色。采用RT-PCR和Western-blot法檢測負(fù)重區(qū)軟骨Col2，aggrec

7、an，MMP-13，COX-2基因和蛋白表達(dá)，采用Western-blot法檢測NF-κB p65和IκBα的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　第一部體外研究
　　所得到的細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形，類似成纖維細(xì)胞的形態(tài)。經(jīng)成臘、成骨和成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，油紅O、茜素紅染色及番紅O染色顯示BMSCs有向以上三個(gè)方向誘導(dǎo)分化的特性。第3代BMSCs的表面分子CD90陽性率為96.20％，CD105陽性率為96.24％，而CD34陽性

8、率僅為1.10％，CD45則為O.73％，符合BMSCs的表型特點(diǎn)。
　　IL-1β顯著上調(diào)MMP-13，COX-2， p-ERK1/2，p-JNK，p-p38，NF-κB p65的表達(dá)，而顯著降低Col2，aggrecan和IκBα的表達(dá)。BMSCs抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-13，COX-2和NF-κB p65的表達(dá)，增加Col2，aggrecan和IκBα的表達(dá)。
　　第二部體內(nèi)研究
　　所有動(dòng)物術(shù)

9、后切口愈合良好。PBS治療組軟骨不平整，關(guān)節(jié)面變形，可見明顯軟骨磨損區(qū)，以股骨內(nèi)髁負(fù)重面破壞嚴(yán)重。BMSCs治療組關(guān)節(jié)軟骨表面基本平坦，有完整軟骨覆蓋但光澤欠佳。ICRS評分結(jié)果顯示BMSCs治療組低于PBS治療組(P＜0.05)。BMSCs治療組HE染色可見軟骨層厚度較PBS組明顯增厚，細(xì)胞數(shù)量較多。BMSCs治療組番紅O染色較PBS組加深，顯示存在較豐富的軟骨基質(zhì)。BMSCs治療組甲苯胺藍(lán)染色相比于PBS組，軟骨表面出現(xiàn)一定的修復(fù)，

10、但軟骨表面仍然有不連續(xù)，包括表面的淺裂痕以及較小區(qū)域的軟骨缺失。改良Mankin評分結(jié)果顯示PBS組評分高于假手術(shù)組(P＜0.05)，BMSCs治療組低于PBS治療組（P＜0.05）。RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示BMSCs抑制了大鼠退變軟骨細(xì)胞MMP-13，COX-2和NF-κB p65的表達(dá)，增加Col2，aggrecan和IκBα的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　BMSCs對大鼠退變軟骨細(xì)胞和OA有明顯改善作用