LINGO-1抗體對多發(fā)性硬化模型小鼠髓鞘和認知功能的影響.pdf

1、本研究中，我們檢測了兩種常見的多發(fā)性硬化脫髓鞘模型小鼠（實驗性過敏性腦脊髓炎模型小鼠和Cuprizone誘導的脫髓鞘模型小鼠）的行為學，并用western blot和免疫熒光技術(shù)等觀察了髓鞘蛋白和神經(jīng)元軸突結(jié)構(gòu)和功能蛋白表達水平以探討:1、脫髓鞘模型小鼠是否存在認知功能障礙，以及小鼠認知功能相關腦區(qū)是否存在髓鞘損傷;2、LINGO-1抗體能否改善脫髓鞘模型小鼠的認知功能障礙及其病理損傷。最終，希望通過以上研究為多發(fā)性硬化認知功能障礙的治

2、療提供新思路，為LINGO-1抗體用于治療多發(fā)性硬化認知功能障礙提供依據(jù)。
　　第一部分 實驗性過敏性腦脊髓炎小鼠的改良與評價
　　目的:為了構(gòu)建能夠用于認知功能行為學檢測的實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE)小鼠，對EAE造模藥物的劑量進行了探索，并對改良的EAE模型進行了評價。
　　方法:采用不同劑量的髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG35-55)（200μg MOG35-55/只、100μg MOG35-55/只、50μg

3、 MOG35-55/只、25μg MOG35-55/只）、滅活結(jié)核分枝桿菌(H37RA)（800μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只、250μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只、100μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只）和百日咳毒素（500 ng百日咳毒素/只、200 ng百日咳毒素/只）等藥物進行EAE造模。造模后，按照神經(jīng)功能評分標準進行神經(jīng)功能評分:用開場試驗檢測小鼠自發(fā)活動能力。
　　結(jié)果:與高劑量藥物EAE造模組小鼠相比，低劑量藥物造模組小鼠（25μg

4、MOG35-55/只，100μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只，200 ng百日咳毒素/只），在病程中，每天的平均神經(jīng)功能評分都明顯降低。低劑量藥物造模EAE組小鼠與陰性對照組相比，自發(fā)活動速度無明顯差別[免疫后第16天，8.885±0.772 cm/s（EAE組），8.933±0.567 cm/s（陰性對照組）;免疫后第31天，11.130±0.630 cm/s（EAE組），10.670±0.959 cm/s（陰性對照組）;免疫后第55天，7.

5、686±0.428 cm/s（EAE組），8.313±0.918 cm/s（陰性對照組）](P＞0.05)。
　　結(jié)論:低劑量藥物（25μg MOG35-55/只，100μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只，200 ng百日咳毒素/只）所造的EAE模型小鼠存在輕度的神經(jīng)功能障礙，但自發(fā)活動功能無明顯損害。該模型可以用于研究多發(fā)性硬化認知功能障礙的病理機制和藥物開發(fā)。
　　第二部分 實驗性過敏性腦脊髓炎小鼠行為學和病理表現(xiàn)
　　目的

6、:探討實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE)小鼠是否存在認知功能障礙（空間學習記憶障礙）和焦慮、抑郁樣行為;探討EAE小鼠認知功能相關的腦區(qū)是否存在脫髓鞘損傷。
　　方法:按照低劑量藥物（25μg MOG35-55/只，100μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只，200 ng百日咳毒素/只）誘導EAE小鼠模型，分別在免疫后的早期（第13天）和免疫后的晚期（第55天）進行行為學檢測，包括糖水偏愛實驗、高架十字迷宮實驗、曠野實驗和水迷宮實驗。在實驗中，每

7、只小鼠只完成其中一個時間點的所有行為學檢測。行為學檢測完成之后，提取腦組織，進行western blot檢測。
　　結(jié)果: EAE小鼠在其病程的早期和晚期，曠野實驗、高架十字迷宮實驗和糖水偏愛實驗中，表現(xiàn)與陰性對照組相當（P＞0.05）。水迷宮實驗中，EAE小鼠在病程的早期，表現(xiàn)與陰性對照組小鼠相當，不存在空間學習記憶障礙（P＞0.05）;但是，EAE小鼠在病程的晚期出現(xiàn)明顯的空間學習記憶障礙，表現(xiàn)為學習期EAE小鼠找到平臺的時間

8、長于對照組小鼠，尤其是學習期第一天(P＜0.05)，檢測期EAE小鼠目標象限運動路程百分比明顯低于對照組的小鼠（P＜0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯示EAE小鼠的海馬旁回和穹窿-海馬傘出現(xiàn)明顯的脫髓鞘損傷，表現(xiàn)為髓鞘堿性蛋白(MBP)含量下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:EAE小鼠在病程的晚期出現(xiàn)空間學習記憶障礙，這種空間學習記憶障礙可能與海馬旁回和穹窿-海馬傘髓鞘損傷有關。
　　第三部分 LINGO-1抗體促

9、進髓鞘修復和EAE小鼠空間學習記憶功能恢復
　　目的:探討LINGO-1抗體能否改善實驗性過敏性腦脊髓炎模型(EAE)小鼠的認知功能障礙（空間學習記憶障礙）及其病理損傷。
　　方法:按照低劑量藥物（25μg MOG35-55/只，100μg滅活結(jié)核分枝桿菌/只，200 ng百日咳毒素/只）誘導EAE小鼠模型;免疫后第14天開始系統(tǒng)的給予LINGO-1抗體治療，劑量為10 mg/kg，每6天一次腹腔給藥，給藥直至行為學檢測結(jié)束

10、;免疫后第50天開始觀察陰性對照組、EAE模型組及EAE模型LINGO-I抗體治療組小鼠空間學習記憶能力和焦慮抑郁樣行為;行為學檢測結(jié)束后，提取腦組織，用western blot和免疫熒光等方法檢測相應腦區(qū)的髓鞘相關蛋白，軸突結(jié)構(gòu)和功能蛋白以及PI3K/AKT/m-TOR信號通路上蛋白的表達。
　　結(jié)果:LINGO-1抗體干預后，三組小鼠在糖水偏愛實驗、曠野實驗及高架十字迷宮實驗中的表現(xiàn)沒有顯著差異(P＞0.05)。而Morris

11、水迷宮實驗中，在學習期和檢測期EAE模型組小鼠的表現(xiàn)明顯差于陰性對照組小鼠，與陰性對照組小鼠相比，學習期EAE小鼠站臺潛伏期明顯延長(P＜0.05)，檢測期站臺周圍活動路程明顯減少(P＜0.05);LINGO-1抗體治療組小鼠在水迷宮實驗的表現(xiàn)優(yōu)于EAE模型組，與EAE未治療組相比，學習期站臺潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，檢測期站臺周圍活動路程有所增加，其活動路程與陰性對照組相當(P＞0.05)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)EAE

12、小鼠的海馬旁回和穹窿-海馬傘出現(xiàn)明顯的脫髓鞘損傷，表現(xiàn)為髓鞘堿性蛋白(MBP)的含量下降(P＜0.05)，并伴有軸突順向轉(zhuǎn)運蛋白驅(qū)動蛋白輕鏈蛋白1(KLC1)含量的下降(P＜0.05)。給予具有重髓鞘功能的LINGO-1抗體干預后， EAE小鼠海馬旁回中的MBP和KLC1明顯升高（P＜0.05），而穹窿-海馬傘的MBP和KLC1無明顯提高(P＞0.05)。此外，LINGO-1抗體治療組小鼠海馬旁回PI3K/AKT/m-TOR信號通路活化

13、，表現(xiàn)為磷酸化的AKT和磷酸化的m-TOR較EAE未治療組表達增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:LINGO-1抗體可能通過修復髓鞘改善EAE小鼠的空間學習記憶障礙;LINGO-1抗體可能是通過活化PI3 K/AKT/m-TOR信號通路來介導這一過程的;LINGO-1抗體治療可能有助于脫髓鞘疾病患者認知功能的恢復。
　　第四部分 LINGO-1抗體能夠改善Cuprizone誘導脫髓鞘模型小鼠的病理損傷
　　目的:探討Cu

14、prizone誘導脫髓鞘小鼠行為學改變以及背側(cè)海馬區(qū)的病理損傷;探討LINGO-1抗體能否改善Cuprizone誘導脫髓鞘小鼠的行為學改變及其病理損傷
　　方法:用0.2％(w/w) cuprizone喂養(yǎng)C57BL/6小鼠誘導脫髓鞘模型，每天喂養(yǎng)直至行為學檢測結(jié)束;在造模后第三周開始進行LINGO-1抗體治療，劑量為10mg/kg，每6天一次腹腔給藥，給藥直至行為學檢測結(jié)束;造模后第9周開始觀察正常對照組、cuprizone誘導

15、脫髓鞘模型組、cuprizone誘導脫髓鞘模型LINGO-I抗體治療組三組小鼠空間學習記憶能力和焦慮抑郁樣行為;行為學檢測結(jié)束后，提取腦組織，采用western blot和免疫熒光等方法檢測背側(cè)海馬區(qū)的髓鞘相關蛋白、軸漿轉(zhuǎn)運相關蛋白、軸突結(jié)構(gòu)蛋白、突觸相關蛋白、tau蛋白、和β淀粉樣蛋白等的表達。
　　結(jié)果:本研究發(fā)現(xiàn)Cuprizone誘導脫髓鞘模型小鼠存在輕度的空間學習能力障礙(P＜0.05)，伴有背側(cè)海馬髓鞘堿性蛋白(MBP)

16、含量下降（P＜0.05）。給予LINGO-1抗體干預后，Cuprizone誘導脫髓鞘小鼠記憶能力輕度提高，并伴有MBP含量增加(P＜0.05)。此外，在Cuprizone誘導脫髓鞘小鼠中，海馬區(qū)同時有軸突功能蛋白順向轉(zhuǎn)運蛋白驅(qū)動蛋白1(KLC1)、軸突結(jié)構(gòu)相關蛋白神經(jīng)絲蛋白輕鏈(NFL)和神經(jīng)絲蛋白重鏈(NF200)含量顯著下降（P＜0.05），LINGO-1抗體干預后，這些軸突功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的水平得以提高（P＜0.05）。然而在C