表達(dá)三種活化型生長(zhǎng)因子細(xì)胞系的建立及其內(nèi)耳誘導(dǎo)分化作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　感音神經(jīng)性耳聾是一種常見(jiàn)的感覺(jué)障礙性疾病，其中先天性重度感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生率約為千分之一，嚴(yán)重困擾著人類(lèi)的健康、生活與交流。但是，現(xiàn)有的治療手段卻很有限，主要是助聽(tīng)器和電子耳蝸植入。助聽(tīng)器對(duì)于中度的耳聾有一定效果，但實(shí)際上只有五分之一的人才能從中獲益。對(duì)于重度感音神經(jīng)性聾，主要依靠電子耳蝸植入，通過(guò)插入耳蝸鼓階內(nèi)的電極直接刺激聽(tīng)神經(jīng)來(lái)重建聾人的聽(tīng)覺(jué)功能，全世界已有超過(guò)300000患者因此獲益。但它是一種侵入性的手術(shù)治

2、療，在噪聲環(huán)境下的言語(yǔ)識(shí)別率還有待進(jìn)一步提高。助聽(tīng)器和電子耳蝸只能作為補(bǔ)償手段改善患者聽(tīng)力，不能從根本上重建受損的聽(tīng)覺(jué)生理功能，逆轉(zhuǎn)患者的聽(tīng)力水平。近年來(lái)生物治療方法在內(nèi)耳細(xì)胞保護(hù)、修復(fù)和再生方面展現(xiàn)出了巨大的潛能，主要有干細(xì)胞移植、基因治療以及生長(zhǎng)因子治療等。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是骨髓中除了造血干細(xì)胞以外的另一類(lèi)具有多系分化潛能、強(qiáng)大自我復(fù)制能力和可移植性的成體干細(xì)胞。

3、在適宜的微環(huán)境下，MSCs可以定向誘導(dǎo)分化為多種組織和細(xì)胞類(lèi)型，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，還可跨胚層分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等。由于MSCs來(lái)源廣泛、容易分離培養(yǎng)、免疫原性低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞移植及基因治療中。
　　生長(zhǎng)因子是一種促進(jìn)特定細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，能和細(xì)胞膜表面的特異性受體結(jié)合從而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路發(fā)揮作用，它們對(duì)多種器官的不同類(lèi)型細(xì)胞的存活、增殖、分化都有調(diào)控作用。在內(nèi)耳發(fā)育成熟過(guò)程中

4、可檢測(cè)到胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insulin-like Growth Factor1，IGF1)、表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor，EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(Fibroblast Growth Factor2，F(xiàn)GF2)三種生長(zhǎng)因子及其受體的表達(dá)，這些生長(zhǎng)因子可保護(hù)內(nèi)耳毛細(xì)胞免受損害并促進(jìn)內(nèi)耳毛細(xì)胞的增殖分化。
　　在感音神經(jīng)性耳聾生物治療中，誘導(dǎo)干細(xì)胞向內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究常采用干細(xì)胞與一些

5、特定組織細(xì)胞共培養(yǎng)以及添加外源性生長(zhǎng)因子的方法。為了將兩種方法結(jié)合用于研究，本文設(shè)計(jì)了一種可同時(shí)表達(dá)三種活化型生長(zhǎng)因子的慢病毒載體并用于構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，試圖為干細(xì)胞移植結(jié)合生長(zhǎng)因子治療感音神經(jīng)性耳聾提供基礎(chǔ)。
　　1、建立表達(dá)三種活化型生長(zhǎng)因子的細(xì)胞系
　　活化型EGF編碼序列采用RT-PCR方法從SW620人大腸癌細(xì)胞中克隆，活化型IGF1和FGF2編碼序列為人工合成。用PCR的方法分別從pSecTag2A和pIRES

6、2-EGFP質(zhì)粒中克隆出引導(dǎo)分泌的免疫球蛋白Igκ鏈信號(hào)肽編碼序列和引導(dǎo)翻譯的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site，IRES)序列。將Igκ鏈信號(hào)肽和三種因子的編碼序列分別融合、由IRES間隔并克隆到帶綠熒光蛋白報(bào)告基因的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLVX-IRES-ZsGreenl上并包裝獲得慢病毒。將慢病毒感染HEK293T細(xì)胞，通過(guò)有限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達(dá)綠熒光蛋白的單細(xì)胞克隆，命名為HEK293T/3

7、GF。用Western blot檢測(cè)單細(xì)胞克隆的IGF1、EGF和FGF2的表達(dá)，并通過(guò)促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分泌的生長(zhǎng)因子的活性。
　　2、共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞分化
　　利用構(gòu)建成功的可同時(shí)表達(dá)三種活化型生長(zhǎng)因子的HEK293T/3GF細(xì)胞與MSCs進(jìn)行共培養(yǎng)，探索其在內(nèi)耳誘導(dǎo)分化中的作用。采用全骨髓貼壁篩選法分離提取大鼠MSCs，體外培養(yǎng)純化擴(kuò)增到第四代后，與表達(dá)活化型生長(zhǎng)因子的HEK2

8、93T/3GF細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，并添加維甲酸(RetinoicAcid，RA)，共培養(yǎng)21天后，顯微鏡下觀察MSCs形態(tài)變化，RT-PCR檢測(cè)毛細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記表達(dá)情況。HEK293T/3GF與MSCs共培養(yǎng)組與對(duì)照組相比，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞形態(tài)向神經(jīng)細(xì)胞樣改變，而且RT-PCR結(jié)果顯示，HEK293T/3GF與MSCs共培養(yǎng)后MSCs表達(dá)毛細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記，說(shuō)明HEK293T/3GF與MSCs共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)MSCs