EML4-ALK融合基因陽性人肺腺癌H2228細(xì)胞株對克唑替尼耐藥前后BIM蛋白變化的檢測.pdf

1、目的:通過克唑替尼誘導(dǎo)耐藥建立人肺腺癌H2228克唑替尼耐藥細(xì)胞株，探討B(tài)IM信號通路在克唑替尼(crizotinib)誘導(dǎo)的EML4-ALK融合基因陽性的人肺腺癌細(xì)胞H2228細(xì)胞株耐藥前后凋亡中的作用，以便為了解克唑替尼產(chǎn)生耐藥機(jī)制和為今后克服耐藥提供理論依據(jù)。
　　方法:1、克唑替尼按50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、500 nmol/L、1000 nmol/L的濃度逐步遞增法誘導(dǎo)人肺腺癌H22

2、28細(xì)胞獲得性耐藥株H2228/CR;
　　2、用不同濃度的克唑替尼分別處理處于對數(shù)生長期的EML4-ALK陽性肺腺癌H2228細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株，并采用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖抑制情況，并分別計(jì)算出克唑替尼在不同細(xì)胞的半抑制濃度(half maximalinhibitory concentration, IC50)值;
　　3、根據(jù)IC50值選用合適濃度的克唑替尼在不同時(shí)間(24h，48h，72h)處理H2228細(xì)胞和H2

3、228/CR細(xì)胞，運(yùn)用AnnexinⅤ流式細(xì)胞儀分別檢測細(xì)胞凋亡率;
　　4、采用Western blotting檢測不同濃度克唑替尼作用72h后(0nm、300nm、1000 nm) H2228和H2228/CR細(xì)胞之間BIM信號通路關(guān)健分子ALK、p-ALK、ERK、p-ERK及BIM（Bim-s、Bim-L、Bim-exL蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:1、經(jīng)過8個(gè)月時(shí)間成功誘導(dǎo)了克唑替尼耐藥細(xì)胞株H2228/CR;

4、　　2、MTT比色法計(jì)算出結(jié)果顯示H2228/CR細(xì)胞在不同濃度克唑替尼作用下的抑制率低于H2228細(xì)胞(P＜0.05);
　　3、MTT比色法計(jì)算出H2228/CR細(xì)胞和H2228細(xì)胞的IC50分別為3418nmol/L、335nmol/L，H2228/CR細(xì)胞對H2228細(xì)胞的耐藥(resistance index，RI)指數(shù)為10.20;
　　4、AnnexinⅤ流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示克唑替尼對H2228細(xì)胞有促凋亡作用，

5、且呈時(shí)間依賴性(P＜0.05)，H2228/CR細(xì)胞的凋亡率明顯低于H2228細(xì)胞的凋亡率(P＜0.05);
　　5、Western blotting檢測到H2228細(xì)胞的ALK磷酸化水平降低，同時(shí)ERK磷酸化水平下調(diào)，BIM的三個(gè)異構(gòu)體Bim-s、Bim-L、Bim-exL蛋白表達(dá)水平上調(diào);而H2228/CR細(xì)胞ALK、ERK的磷酸化水平無明顯變化，BIM蛋白表達(dá)水平也無明顯變化。
　　結(jié)論:利用克唑替尼建立了人肺腺癌H2