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1、伊立替康是廣泛用于治療晚期結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的化療藥,然而其治療存在較大毒性,常發(fā)生遲發(fā)性腹瀉及嚴(yán)重中性粒細(xì)胞減少癥。研究表明個(gè)體UGT1A1基因多態(tài)性狀態(tài)與伊立替康治療不良反應(yīng)密切相關(guān)。為優(yōu)化臨床伊立替康藥物療效的管理,國(guó)內(nèi)越來越多的實(shí)驗(yàn)室開展了UGT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)。室間質(zhì)量評(píng)價(jià)是UGT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)質(zhì)量保證的重要內(nèi)容。在本研究之前,中國(guó)UGT1A1基因多態(tài)性分型的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)尚為空白。為了提高臨床實(shí)驗(yàn)室UGT1A1基因分
2、型能力,本研究第一部分中以可模擬真實(shí)臨床樣本的UGT1A1基因多態(tài)性細(xì)胞系為質(zhì)控品,將其用于實(shí)驗(yàn)室基因多態(tài)性檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià),探討該質(zhì)控品的實(shí)用性和各臨床實(shí)驗(yàn)室UGT1A1基因多態(tài)性分型能力。
制備的細(xì)胞質(zhì)評(píng)樣本由3種不同UGT1A1基因多態(tài)性的永生化人淋巴細(xì)胞系組成。首先對(duì)制備的細(xì)胞質(zhì)評(píng)樣本性能進(jìn)行了驗(yàn)證分析,其穩(wěn)定性及均一性符合室間質(zhì)評(píng)樣本的要求。采用PCR-Sanger測(cè)序法對(duì)不同基因型進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與預(yù)期相符。隨后將制
3、備的該質(zhì)評(píng)樣本組成包括10支樣本的室間質(zhì)評(píng)樣本盤,發(fā)放至全國(guó)45家臨床實(shí)驗(yàn)室。共收到45份有效回報(bào)結(jié)果,檢測(cè)結(jié)果完全正確實(shí)驗(yàn)室為97.7%(44/45);所有參評(píng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的樣本符合率為99.4%,僅一份假陰性結(jié)果,無假陽性結(jié)果;使用最多的檢測(cè)方法是PCR-測(cè)序法(75.6%,34/45),其中24份結(jié)果采用PCR-焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)。本研究第一部分成功運(yùn)用含UGT1A1多態(tài)性的細(xì)胞樣本進(jìn)行全國(guó)室間質(zhì)評(píng),細(xì)胞樣本較臨床標(biāo)本來源更穩(wěn)定,異質(zhì)
4、性小,容易大量制備,可有效用于UGT1A1多態(tài)性基因分型檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。本次室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的結(jié)果表明,國(guó)內(nèi)大多數(shù)UGT1A1基因分型實(shí)驗(yàn)室具備正確分型UGT1A1基因多態(tài)性的能力。
非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的EML4-ALK融合基因是化療藥物ALK激酶抑制劑—克唑替尼的分子靶標(biāo),而選擇克唑替尼治療的前提為準(zhǔn)確和可靠地檢測(cè)出ALK基因重排。目前熒光原位雜交(fluores
5、cence in situhybridization,F(xiàn)ISH)是臨床EML4-ALK融合基因檢測(cè)驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)方法,但存在價(jià)格昂貴,操作規(guī)范要求較高,檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn),因此EML4-ALK融合基因的檢測(cè)方法仍有待改進(jìn)。
本研究第二部分的目的是以CRISPR-Cas9(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated
6、 easpase9(Cas9))技術(shù)平臺(tái)為基礎(chǔ),利用核酸酶失活的Cas9(nuelease-deficient Cas9,dCas9)與sgRNA(singleguide RNA)組裝后具有與靶序列結(jié)合而不對(duì)其切割的特點(diǎn),將熒光標(biāo)記的dCas9蛋白與靶向ALK基因的sgRNA分子體外組裝為核酸探針,建立針對(duì)EML4-ALK基因重排檢測(cè)的新方法,首次探討該技術(shù)在臨床分子診斷中的應(yīng)用價(jià)值。本研究中,通過原核表達(dá)純化dCas9蛋白,其中dCa
7、s9蛋白融合表達(dá)Halo標(biāo)簽,可采用多種Halo熒光配基實(shí)現(xiàn)對(duì)dCas9蛋白不同熒光標(biāo)記。首先以端粒重復(fù)序列的檢測(cè)對(duì)sgRNA/dCas9檢測(cè)體系進(jìn)行了驗(yàn)證及優(yōu)化。通過設(shè)計(jì)端粒sgRNA,體外與dCas9蛋白組裝后檢測(cè)本研究中所用細(xì)胞系的端粒,結(jié)果顯示端粒-sgRNA/dCas9復(fù)合物可成功檢測(cè)體外固定細(xì)胞中染色體端粒。隨后,以含串聯(lián)重復(fù)序列的MUC4基因2號(hào)外顯子及相鄰3號(hào)內(nèi)含子為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA,與兩種不同熒光標(biāo)記的dCas9蛋白
8、分別組裝,進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法進(jìn)行雙基因標(biāo)記的能力。利用該檢測(cè)體系對(duì)非小細(xì)胞肺癌EML4-ALK融合基因進(jìn)行了檢測(cè)。本研究中ALK為單拷貝基因,為提高熒光檢測(cè)靈敏度,對(duì)ALK基因重排位點(diǎn)上下游各約5kb特異靶序列分別設(shè)計(jì)多條sgRNAs,組裝兩種熒光標(biāo)記的dCas9蛋白后分別對(duì)肺癌EML4-ALK陽性細(xì)胞系及陰性細(xì)胞系進(jìn)行ALK基因重排檢測(cè)。初步結(jié)果顯示,由于該檢測(cè)體系加入多條sgRNA序列,熒光標(biāo)記信噪比較重復(fù)序列檢測(cè)低,結(jié)果觀察不明顯
9、;對(duì)于EML4-ALK陽性的細(xì)胞系,可在少數(shù)細(xì)胞中觀察到分離熒光信號(hào)的陽性結(jié)果;對(duì)于EML4-ALK陰性的對(duì)照細(xì)胞系,熒光重合點(diǎn)較預(yù)期結(jié)果少,需進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)條件。綜上所述,基于CRISPR/dCas9系統(tǒng)的體外基因檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便,省時(shí),具有良好的應(yīng)用前景。首次通過該檢測(cè)方法初步探討了其對(duì)非小細(xì)胞肺癌ALK基因重排的檢測(cè),結(jié)果顯示該方法對(duì)ALK基因重排具有一定的檢測(cè)能力,但仍需對(duì)方法學(xué)進(jìn)行優(yōu)化后進(jìn)一步驗(yàn)證。
本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主
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