煙草提取物誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C-9吉非替尼耐藥相關(guān)機(jī)制及對(duì)克服耐藥的探索.pdf

1、目的：探討煙草提取物（cigarette smoke extract，CSE）誘導(dǎo)EGFR敏感性突變?nèi)朔蜗侔┘?xì)胞株P(guān)C-9吉非替尼耐藥的可能相關(guān)分子機(jī)制及乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）能否逆轉(zhuǎn)CSE誘導(dǎo)的PC-9細(xì)胞吉非替尼耐藥。
　　方法：
　　以不同濃度 CSE處理 PC-9細(xì)胞不同時(shí)間，檢測(cè)其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物（epithelial to mesenchymal transition，EM

2、T）E-cadherin、Vimentin表達(dá)，篩選出合適的工作時(shí)間及工作濃度。觀察 CSE暴露(10％CSE組)、Src抑制劑PP2預(yù)處理后CSE暴露（PP2+10%CSE組）、NAC預(yù)處理后CSE暴露（NAC+10%CSE組）對(duì)PC-9細(xì)胞E-cadherin、Vimentin及EMT相關(guān)信號(hào)通路蛋白、mRNA表達(dá)，PC-9對(duì)吉非替尼敏感性，細(xì)胞形態(tài)學(xué)及侵襲遷移能力等的影響。
　　以qRT-PCR法檢測(cè)E-cadherin、V

3、imentin mRNA表達(dá)；Western blot法檢測(cè) E-cadherin、Vimentin、Src、p-Src蛋白表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及E-cadherin、Vimentin的定位、半定量；CCK-8法檢測(cè)吉非替尼及NAC對(duì)細(xì)胞增殖抑制情況；Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。
　　結(jié)果：
　　qRT-PCR結(jié)果顯示：隨著CSE濃度的增加（0，2.5%CSE，5%CSE，1

4、0%CSE）暴露時(shí)間的延長(zhǎng)（0，24h，48h，72h），PC-9細(xì)胞E-cadherin表達(dá)逐漸減少，Vimentin表達(dá)逐漸增加，篩選出后續(xù)實(shí)驗(yàn)CSE濃度為10%CSE，暴露時(shí)間為72h。10%CSE組E-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組（p<0.001），Vimentin mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組（p<0.001）。PP2+10%CSE組及 NAC+10%CSE組E-cadherin mRNA

5、相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于10%CSE組（p均<0.01）；Vimentin mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯低于10%CSE組（p均<0.001）。
　　Western blot結(jié)果顯示：E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)情況與qRT-PCR結(jié)果一致。p-Src蛋白表達(dá)量在10%CSE組明顯高于空白對(duì)照組；而PP2+10%CSE組、NAC+10%CSE均明顯低于10%CSE組。
　　細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示：Vimentin

6、表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，E-cadherin表達(dá)于細(xì)胞膜, E-cadherin、Vimentin表達(dá)量與qRT-PCR及Western blot結(jié)果一致。10%CSE組PC-9細(xì)胞由上皮樣形狀變成長(zhǎng)梭形、紡錘形；而PP2+10%CSE組、NAC+10%CSE組PC-9細(xì)胞仍呈上皮樣形狀。
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：NAC對(duì)PC-9細(xì)胞的無毒劑量為5mM。吉非替尼對(duì)空白對(duì)照組、10%CSE組、PP2+10%CSE組、NAC+10%CSE組

7、PC-9細(xì)胞的IC50分別為（0.0566±0.0060）μM、（0.8340±0.2780）μM、（0.1380±0.0878）μM、（0.1650±0.0242μM]，其中10%CSE組明顯高于空白對(duì)照組（p<0.01），而PP2+10%CSE組及NAC+10%CSE組則明顯低于10%CSE組(p均<0.05)。
　　Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：10%CSE組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于空白對(duì)照組（p<0.0001）, PP2+10

8、%CSE組及NAC+10%CSE組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于10%CSE組（p均<0.0001）。
　　劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:10%CSE組PC-9細(xì)胞遷移距離明顯大于空白對(duì)照組；PP2+10%CSE組、NAC+10%CSE組PC-9細(xì)胞遷移距離明顯小于10%CSE組。
　　結(jié)論：
　　1. CSE可誘導(dǎo)PC-9肺腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，且呈時(shí)間依賴性、濃度依賴性；
　　2. CSE可誘導(dǎo)PC-9肺腺癌細(xì)胞吉非替尼耐藥；