肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白TAGLN2在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，且其發(fā)病率逐年升高。雖然PTC總體預(yù)后較好，但容易復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這嚴(yán)重影響患者的生存預(yù)后。因此，進(jìn)一步探索研究與PTC惡性生物學(xué)特征相關(guān)的因素，揭示PTC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)尋找用于PTC的早期診斷、治療及判斷預(yù)后的干預(yù)靶點(diǎn)，改善病人生存及預(yù)后具有重要意義。細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能的改變是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素。肌

2、動(dòng)蛋白是細(xì)胞骨架的關(guān)鍵成分，它通過與肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)，繼而參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖及凋亡等生命過程。TAGLN2(Transgelin-2)是一種重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其唯一的功能域CH(calponin homolog)結(jié)構(gòu)域可以通過與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞骨架重構(gòu)，從而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。目前許多人類惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)TAGLN2過度表達(dá)，且沉默TAGLN2后可以使癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力減弱，細(xì)胞凋亡能力增加。

3、因此，TAGLN2可能是一個(gè)潛在的腫瘤干預(yù)治療靶點(diǎn)。但是TAGLN2在PTC發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及預(yù)后價(jià)值尚不清楚。本課題對(duì)TAGLN2在PTC發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　方法：⑴收集74例甲狀腺乳頭狀癌患者的癌組織和癌旁2cm甲狀腺正常組織（經(jīng)病理切片證實(shí)未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞）。應(yīng)用免疫組織化學(xué)(IHC，Immunohistochemistry)、實(shí)時(shí)定量PCR(q-PCR，real-time quantita

4、tive polymerase chainreaction)以及Western Blot蛋白印跡檢測(cè)PTC癌組織和配對(duì)癌旁正常組織中TAGLN2蛋白及mRNA的表達(dá)情況，并分析TAGLN2異常表達(dá)與PTC病人臨床病理特征之間的關(guān)系。⑵培養(yǎng)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系，通過慢病毒轉(zhuǎn)染沉默TAGLN2基因的表達(dá)并構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。然后Western及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TAGLN2蛋白及mRNA表達(dá)水平評(píng)估轉(zhuǎn)染效率;通過MTT法檢測(cè)沉默TAGLN2

5、對(duì)PTC細(xì)胞增殖能力的影響;Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默TAGLN2對(duì)PTC細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響;7-amino-actinomycin D(7-AAD)染色法檢測(cè)沉默TAGLN2對(duì)PTC細(xì)胞凋亡能力影響;碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)法檢測(cè)干擾TAGLN2基因?qū)TC細(xì)胞周期的影響。⑶Western blot蛋白印跡法檢測(cè)下調(diào)TAGLN2表達(dá)后細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、抗凋亡因子Bcl-2及侵襲轉(zhuǎn)

6、移相關(guān)蛋白MMP-2/MMP-9的表達(dá)，并檢測(cè)信號(hào)分子p-Akt、Akt、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)水平評(píng)估增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)的PI3K/Akt及MAPK/ERK信號(hào)通路激活情況;同時(shí)，免疫沉淀(IP，immunoprecipitation)聯(lián)合液相色譜質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS， liquid chromatographycoupled with tandem mass spectrometry)篩查TAGLN2互作蛋白。

7、>　　結(jié)果：①IHC結(jié)果顯示，癌組織中TAGLN2表達(dá)陽性率為74.3％(55/74)，癌旁組織僅為32.4％(24/74)，明顯低于癌組織(p＜0.001);Western及q-PCR結(jié)果顯示癌組織中TAGLN2蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.520±0.180和2.463±1.030，明顯高于癌旁組織（0.255±0.120和1.077±0.461，p＜0.001）;且其異常表達(dá)僅與PTC淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(p＜0.05)，而與患者

8、年齡、性別，腫瘤大小、包膜侵犯及多灶性之間沒有關(guān)系(p＞0.05)。②與未轉(zhuǎn)染組(con)和空載體組(neg-shRNA)相比，沉默組(TAGLN2-shRNA)中TAGLN2蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(p＜0.05)，而未轉(zhuǎn)染組和空載體組間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。MTT法檢測(cè)沉默TAGLN2基因?qū)TC細(xì)胞增殖能力影響:K1、TPC-1和BCPAP細(xì)胞沉默組比未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力明顯降低。Transwell檢測(cè)干

9、擾TAGLN2基因?qū)TC細(xì)胞遷移侵襲能力的影響:對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，K1細(xì)胞未感染組，空載體組及沉默組平均細(xì)胞數(shù)分別為210±14，209±34，107±14，TPC-1細(xì)胞為259±34，238±51，138±20，BCPAP細(xì)胞分別為285±36，263±35及150±8;對(duì)侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)，K1細(xì)胞未感染組，空載體組及沉默組平均細(xì)胞數(shù)分別為112±7，101±13，50±5，TPC-1細(xì)胞為141±12，144±7，70±5，BCP

10、AP細(xì)胞分別為179±37，165±42及58±5，沉默TAGLN2后PTC細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯減弱(p＜0.05)，而未轉(zhuǎn)染組與空載體組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。7-AAD檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾TAGLN2基因使PTC細(xì)胞凋亡能力增加:未感染組，空載體組及沉默組K1細(xì)胞凋亡率分別為2.853±0.146％，2.810±0.111％和16.147±2.451％，TPC-1細(xì)胞為3.713±0.375％，3.350±0.303％和33

11、.040±0.867％，BCPAP細(xì)胞為2.670±0.141％，2.603±0.190％和9.863±1.184％。碘化丙啶染色檢測(cè)沉默TAGLN2基因?qū)TC細(xì)胞周期的影響:結(jié)果顯示，沉默組與未轉(zhuǎn)染組和空載體組相比，K1細(xì)胞G1期增多(46.900±4.243％ vs47.393±3.206％ vs64.349±0.953％)(p＜0.05)，S期明顯減少(39.483±5.882％ vs38.728±4.991％ vs22.076

12、±2.384％)(p＜0.05)，G2期無變化差異(13.613±1.651％ vs13.875±1.778％ vs13.573±1.669％)(p＞0.05); TPC-1細(xì)胞G1期增多(30.695±3.594％ vs32.954±1.713％ vs40.773±3.984％)(p＜0.05),S期減少(29.543±2.148％ vs27.310±3.334％ vs20.810±1.009％)(p＜0.05)，G2期無明顯變化(3

13、9.763±4.756％ vs39.734±3.816％ vs38.415±3.504％)(p＞0.05);BCPAP細(xì)胞G1期顯著增多(25.705±2.219％vs26.375±3.170％vs54.100±4.959％)(p＜0.05)，S期明顯減少(60.305±2.624％vs60.723±1.732％vs34.478±1.370)(p＜0.05)，G2期無明顯變化(13.988±4.213％ vs12.990±4.459％

14、vs11.424±3.702％)(p＞0.05)。說明沉默TAGLN2誘導(dǎo)PTC細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。③Western blot用于檢測(cè)下調(diào)TAGLN2基因后，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、抗凋亡蛋白Bcl-2及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2/MMP-9表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，K1細(xì)胞中沉默組CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)水平(0.355±0.074)明顯低于未轉(zhuǎn)染組(0.745±0.154，p=0.001)和空載體組(0.7

15、82±0.189，p=0.001); Bcl-2蛋白在沉默組中表達(dá)水平(0.328±0.142)明顯低于未轉(zhuǎn)染組(0.977±0.183，p=0.002)和空載體組(0.916±0.127，p=0.003);沉默組MMP-2和MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)(0.256±0.056，0.394±0.176)也明顯低于未轉(zhuǎn)染(0.625±0.021，p=0.001;0.700±0.161，p=013)和空載體組(0.623±0.116，p=0.0

16、01;0.734±0.162，p=0.007)。TPC-1細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組、空載體組和沉默組中CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.883±0.124、0.922±0.180、0.487±0.209，沉默組明顯低于未轉(zhuǎn)染組(p=0.004)和空載體組(p=0.002);未轉(zhuǎn)染組、空載體組和沉默組中Bcl-2蛋白表達(dá)水平分別為1.040±0.235、1.068±0.233、0.378±0.219，沉默組明顯低于未轉(zhuǎn)染(p=0.007)和空

17、載體組(p=0.007):另外沉默組中MMP-2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.290±0.181和0.516±0.124，明顯低于未轉(zhuǎn)染組(0.717±0.185，p=0.009;0.812±0.143，p=0.005)和空載體組(0.603±0.275，p=0.043;0.825±0.136，p=0.003)。BCPAP細(xì)胞TAGLN2沉默組CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.297±0.135和0.3

18、94±0.104，明顯低于未轉(zhuǎn)染(0.561±0.084，p=0.016;0.932±0.208，p=0.008)和空載體組(0.623±0.205，p=0.005;0.841±0.184，p=0.018)，沉默組MMP-2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.379±0.160和0.247±0.124，明顯低于未轉(zhuǎn)染組(0.873±0.224，p=0.027;0.697±0.159，p=0.001)和空載體組(0.844±0.233，

19、p=0.034;0.688±0.177，p=0.001)。而未轉(zhuǎn)染組和空載體組組間CyclinD1、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。除此之外，通過Western blot對(duì)PTC細(xì)胞未感染組，空載體組及沉默組中Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)差異進(jìn)行檢測(cè)，觀察沉默TAGLN2基因?qū)I3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)通路激活的影響:K1細(xì)胞中沉默組p-Akt和p

20、-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯低于未轉(zhuǎn)染組和空載體組(0.332±0.112 vs0.861±0.151 vs0.729±0.124,0.575±0.076 vs1.167±0.143 vs1.005±0.186;p＜0.001), TPC-1細(xì)胞TAGLN2基因沉默組p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.564±0.226和0.537±0.075，明顯低于未轉(zhuǎn)染(1.135±0.236，p=0.004;0.

21、945±0.136，p=0.000)和空載體組(1.151±0.285，p=0.003;1.070±0.146，p=0.000)，BCPAP細(xì)胞沉默組p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)為0.493±0.214，p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)水平為0.501±0.223，明顯低于未轉(zhuǎn)染(0.867±0.179，p=0.034;0.855±0.068，p=0.012)和空載體組(0.861±0.326，p=0.037;0.967±0.230，p=0.00

22、2)，而三種細(xì)胞未感染組，空載體組及沉默組中Akt和ERK1/2蛋白表達(dá)水平無明顯差異(p＞0.05)。另外，免疫沉淀-質(zhì)譜聯(lián)用發(fā)現(xiàn)TAGLN2可能與ACTB、MYH9、ARP-2、ARP-3等蛋白互作。
　　結(jié)論：⑴TAGLN2的蛋白和mRNA在PTC癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且與PTC的淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。⑵沉默TAGLN2基因明顯抑制PTC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯。TAGLN2在促進(jìn)PT