金釵石斛多糖的結構鑒定及其乙酰化和硫酸化衍生物的生物活性研究.pdf

1、目的：金釵石斛多糖被證明是活性成分，但到目前為止其具體結構與相關活性研究仍然不是十分清楚。故深入的研究其結構與活性，將為金釵石斛基于多糖的物質基礎及質量控制研究及其相關創(chuàng)新藥物研究奠定基礎。
　　方法：本課題對粗多糖的提取采用了沸水提取和酶聯(lián)水提的兩種方法。粗多糖經 DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱分離純化后，進一步運用凝膠柱Sephacryl S-100 HR純化得到均一多糖。高效凝膠滲透色譜（HPG

2、PC）用于測定多糖的純度和分子量。PMP衍生法結合高效液相色譜（HPLC）和糖醇乙酸酯法結合氣相色譜（GC）用于單糖組成測定。多糖的結構解析采用化學和儀器分析相結合的方法。包括FTIR、GC、GC-MS、甲基化、部分酸水解和核磁共振分析等。采用三氧化硫吡啶絡合物對金釵石斛多糖JCS1進行硫酸化修飾，采用乙酸酐對金釵石斛多糖JCS1進行乙?；揎棥C-12細胞用于乙?；疴O石斛多糖對神經細胞軸突的分化影響實驗。人微血管內皮細胞（HMEC

3、-1）用于評價細胞遷移和管腔形成實驗。雞胚絨毛尿囊膜實驗用于多糖體內抗血管生成活性評價實驗。
　　結果：金釵石斛的干燥莖經沸水提取后得到粗多糖JCS（47.96 g，產率1.20％）。JCS經分離純化得到兩種水溶性均一多糖JCS0（122.0 mg，產率0.25%）、JCS1（4.50 g，產率9.38%）和粗多糖JCS2（661.0 mg，產率1.38%）。JCS2經Sephacryl HR-100柱純化得到均一多糖JCS2S1

4、（174.5 mg，產率0.36%）。沸水提取后藥材殘渣經堿提取得到粗多糖JCN（4.03 g,產率0.08%），將JCN分離純化得到均一多糖JCN1-1（151.0 mg，產率3.75%）。酶聯(lián)水提后得到粗多糖AJCS（33.45 g，產率0.67%）。AJCS經陰離子交換柱DEAE Sepharose Fast Flow純化得到兩個組分AJCS1A（1.42 g，產率4.20%）和AJCS1B（1.20 g，產率3.60%）。AJC

5、S1A經酶解后得到組分1AE（470.0 mg，產率33.10%），將1AE進一步分離純化得到兩種均一多糖1AE1（71.0 mg，產率15.10%）和1AE2（41.0 mg，產率8.75%）。AJCS1B經純化得到均一多糖B1（117.0 mg，產率9.75%）。
　　高效凝膠色譜（HPGPC）分析表明JCS0、JCS1、JCS2S1、JCN1-1、1AE1、1AE2和B1的分子量分別為14.3 kD、12.3 kD、54.0

6、 kD、20.3 kD、89.0 kD、37.1 kD和94.8 kD。而其中六種均一多糖JCS0、JCS1、JCN1-1、1AE1、1AE2和B1為中性多糖，JCS2S1為酸性多糖。JCS0由甘露糖和葡萄糖組成，其摩爾比為4.6:1.0。JCS1由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成，其摩爾為40.2:6.1:4.8:2.9:1.9。JCS2S1含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其摩爾比為3.

7、1:2.5:1.0:1.1:4.4:5.7:1.5。JCN1-1由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖組成，摩爾比為1.8:1.0:16.6:1.2:6.6。1AE1含有含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩爾比為1.0:4.3:1.0:2.4:25.6:17.3。1AE2含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩爾比為1.0:9.4:3.2:1.3:12.0:18.7。B1含有葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖

8、，其摩爾比為1.0:1.9:1.5。對JCS1、B1和1AE2進行甲基化分析，確定了三種均一多糖的糖殘基連接方式和摩爾比。分析結果為 JCS1含有1,4-Glcp，1,6-Glcp，T-Glcp，T-Galp，1,4,6-Glcp，1,4-Manp，1,4-Xylp，1,3,6-Glcp和T-Araf九種連接方式，其摩爾比為34.2:2.0:2.6:1.2:3.2:2.2:1.6:1.4:1.0。B1含有1,4-Glcp，1,6-Glc

9、p，1,6-Galp，T-Glcp，1,3,6-Galp，1,3-Galp和 T-Araf七種連接方式，其摩爾比為3.7:5.5:1.3:1.0:6.2:4.0:7.3。1AE2含有1,6-Glcp，T-Glcp，T-Galp，1,3,6-Galp，1,3-Galp和T-Araf六種連接方式，其摩爾比為5.2:1.3:1.0:2.5:3.0:1.3。
　　對JCS1進一步的結構解析表明JCS1是以1,4-α-Glcp為主鏈，在其C

10、-6有分支。研究發(fā)現(xiàn)支鏈是呈現(xiàn)三種不同的連接方式。第一種是在1,4-α-Glcp的C-6上連接1,6-β-Glcp，而1,6-β-Glcp的C-6與1,4-β-Manp相連，最后1,4-β-Manp的C-4位與T-α-Glcp相連。第二種則與第一種的連接方式相似，只是末端不是T-α-Glcp，而是有T-α-Galp組成。第三種連接方式則是在1,4-α-Glcp的C-6上連接1,3,6-β-Glcp，而在1,3,6-β-Glcp的C-3位

11、連接1,4-α-Xylp，1,4-α-Xylp的C-4與T-α-Araf相連；在1,3,6-β-Glcp的C-6位連接的是T-α-Glcp。
　　對多糖的生物活性研究表明，JCS1的乙?；苌颵JCS1在低濃度（5.56μM）和高濃度（55.56μM）對PC-12細胞的神經軸突生長有促進作用。而JCS1的硫酸化衍生物JCS1S2在極低的濃度（0.2μM）能使人微血管內皮細胞（HMEC-1）管腔受到完全地破壞。此外該多糖對HMEC

12、-1細胞的遷移也有明顯的抑制作用。體內實驗表明，硫酸化多糖JCS1S2能顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜上血管生成。
　　結論：從金釵石斛干燥莖中提取分離純化出六種中性多糖（JCS0、JCS1、JCN1-1、1AE1、1AE2、B1）和一種酸性多糖（JCS2S1）。其中JCS1是1,4-α-D-Glcp為主鏈的半乳甘露葡聚糖。JCS1的乙?；苌颵JCS1對PC-12細胞神經軸突生長有促進作用。而JCS1的硫酸化衍生物JCS1S2對HME