基因芯片篩選人腦創(chuàng)傷皮層差異表達(dá)基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測(cè)人創(chuàng)傷大腦皮層與正常大腦皮層基因表達(dá)譜的差異，篩選差異表達(dá)基因，尋找腦創(chuàng)傷防治的新的分子生物學(xué)策略。 方法：1.收集5例我院神經(jīng)外科因腦創(chuàng)傷后行顱內(nèi)減壓手術(shù)時(shí)清除的挫裂傷灶緣相當(dāng)于傷灶周圍水腫區(qū)的腦額葉皮層組織，顯微鏡下清除軟膜及血管。受傷至手術(shù)取材時(shí)間均在48小時(shí)內(nèi)。Trizol一步法提取組織總RNA，并用RNeasyminispincolumn過柱純化，最后用分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。正常對(duì)照的人腦皮層總

2、RNA購自美國(guó)Ambion公司。T7promoter-Oligo(dT)15為引物，用cDNASynthesisKit合成雙鏈cDNA，雙鏈合成以后用QIAquickPCRPurificationKit純化。用T7RiboMAXRNA大量產(chǎn)物系統(tǒng)將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA。用SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶，隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再純化。再以隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA的KLENOW酶標(biāo)記，創(chuàng)傷腦組織摻入Cy5-dCTP、正常對(duì)照腦組

3、織摻入Cy3-dCTP。預(yù)先用芯片點(diǎn)樣儀在75mm×25m、經(jīng)過氨基修飾的載玻片上點(diǎn)制21，329條70mer長(zhǎng)度的相關(guān)基因?qū)?yīng)的探針，另外還點(diǎn)上人類的12個(gè)看家基因作為陽性對(duì)照，12條人工合成的與人基因沒有同源性的70mer作為陰性對(duì)照，及酵母的8個(gè)基因作為基因芯片外標(biāo)對(duì)照。熒光素標(biāo)記的cDNA探針和芯片在雜交液中42℃雜交過夜，然后洗脫、甩干。最后用LuxScan雙通道激光掃描儀掃描。采用GenePixPro4.0圖像分析軟件讀取數(shù)

4、據(jù)，刪除弱點(diǎn)和壞點(diǎn)，用Lowess方法歸一化數(shù)據(jù)及校正；將歸一化和校正后的Cy-5/Cy-3值作為差異判別的ratio值，最后以ratio值大于2或小于0.5(即兩倍的標(biāo)準(zhǔn))來確定差異表達(dá)基因； 2.隨機(jī)挑選4個(gè)共同差異表達(dá)的基因做熒光定量PCR驗(yàn)證； 3.用RT-PCR方法擴(kuò)大樣本驗(yàn)證芯片篩選出的差異表達(dá)基因spp1、cyr61、plscr1在人腦創(chuàng)傷皮層中的表達(dá)情況。 結(jié)果：1.T1vsN芯片上表達(dá)基因總數(shù)為

5、8828個(gè)，T2vsN芯片上表達(dá)基因總數(shù)為9911個(gè)，T3vsN芯片上表達(dá)基因總數(shù)為9213個(gè)，T4vsN芯片上表達(dá)基因總數(shù)為9078個(gè)。按照2倍變化的判定標(biāo)準(zhǔn)，T1vsN芯片上T1與N差異表達(dá)的基因數(shù)為362個(gè)(4％)，其中表達(dá)上調(diào)的為210個(gè)，下調(diào)的為152個(gè)；T2vsN芯片上T2與N差異表達(dá)的基因數(shù)為476個(gè)(5％)，其中表達(dá)上調(diào)的為249個(gè)，下調(diào)的為227個(gè)；T3vsN芯片上T3與N差異表達(dá)的基因數(shù)為627個(gè)(7％)，其中表達(dá)上

6、調(diào)的為381個(gè)，下調(diào)的為246個(gè)；T4vsN芯片上T4與N差異表達(dá)的基因數(shù)為973個(gè)(11％)，其中表達(dá)上調(diào)的為573個(gè)，下調(diào)的為400個(gè)；T5vsN芯片上T5與N差異表達(dá)的基因數(shù)為1757個(gè)(20％)，其中表達(dá)上調(diào)的為823個(gè)，下調(diào)的為934個(gè)。在5張芯片上共同差異表達(dá)的基因數(shù)為87個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的為60個(gè)，下調(diào)的為27個(gè)。上調(diào)的60個(gè)基因中，16個(gè)為未知功能類或EST片段，44個(gè)為已知功能類基因，分屬于12類功能基因，其中，主要為

7、代謝類(26個(gè))，應(yīng)激反應(yīng)類(12個(gè))，凋亡類(9個(gè))，信號(hào)類(9個(gè))等為主；下調(diào)的27個(gè)基因中，20個(gè)為未知功能類或EST片段，7個(gè)為已知功能類基因，分屬于4類功能基因，其中，以代謝類為主(6個(gè))； 2.隨機(jī)挑選的4個(gè)共同差異表達(dá)基因的熒光定量PCR值和芯片數(shù)據(jù)基本吻合； 3.RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基因芯片篩選出的表達(dá)上調(diào)的基因spp1、cyr61、plscr1在29例人腦創(chuàng)傷皮層中均表達(dá)明顯上調(diào)。 結(jié)論：1.基

8、因芯片能高效地篩選出人腦創(chuàng)傷后大腦皮層的差異表達(dá)基因，且實(shí)時(shí)定量PCR原樣本驗(yàn)證證實(shí)了該芯片數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，RT-PCR擴(kuò)大樣本驗(yàn)證證實(shí)了該芯片結(jié)果具有代表性。 2.經(jīng)在pubmed上對(duì)這些共同差異表達(dá)的基因逐個(gè)檢索，發(fā)現(xiàn)所有下調(diào)的基因在以前的腦創(chuàng)傷文獻(xiàn)中未有提及，上調(diào)基因中也僅少部分被報(bào)道過，如cd44、ccl2、tieg、vegf、cd14、idha、xbp1、egr1、rgs2、fos、il-1b、timp1、gadd45a、