EB病毒相關(guān)胃癌中RASSF1A基因甲基化狀態(tài)和表達(dá)的研究.pdf

1、EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是皰疹病毒屬γ皰疹病毒亞科成員，是重要的DNA腫瘤病毒。EBV感染與部分胃癌的關(guān)系已經(jīng)得到確認(rèn)，但EBV相關(guān)胃癌(EBV-associated gastric carcinoma, EBVaGC)的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。近來(lái)研究表明EBV可能通過誘導(dǎo)某些抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化而使該基因功能失活參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。
　　目的：明確EBV陽(yáng)性和陰性胃癌細(xì)胞系以及EBV

2、aGC和EBV陰性胃癌(EBV-negatived gastric carcinoma, EBVnGC)組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)以及對(duì)其表達(dá)的影響，為進(jìn)一步明確Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族基因1A(ras associated domain family gene1A, RASSF1A)基因在EBVaGC發(fā)生中的作用及作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：采用甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PC

3、R, MSP)和基于焦亞硫酸氫鹽修飾的基因組測(cè)序法(Bisulfite genomic sequencing, BGS)檢測(cè)5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine,5-Aza-dc)處理前后8種胃癌細(xì)胞系以及胃癌組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time quantitative PCR, real time qPCR)檢測(cè)EBV陰性及陽(yáng)性細(xì)胞系中RASSF1AmRN

4、A的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；免疫組化技術(shù)檢測(cè)EBVaGC和EBVnGC組織中RASSF1A蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：①M(fèi)SP檢測(cè)結(jié)果顯示4種EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞系(GT38, GT39, SNU719, AGS-EBV) RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)呈未甲基化狀態(tài)，電泳結(jié)果為U型，4種EBV陰性胃癌細(xì)胞系(HGC-27, MKN-45, SGC7901, AGS) RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)，電泳結(jié)果為M型。BGS檢測(cè)RASSF1A基因啟

5、動(dòng)子區(qū)的86個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示：4種EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞系除少量位點(diǎn)發(fā)生甲基化外，其余位點(diǎn)均未發(fā)生甲基化，甲基化率均小于10%；而4種EBV陰性胃癌細(xì)胞系則表現(xiàn)為幾乎所有位點(diǎn)的甲基化，甲基化率均達(dá)90%以上。②MSP檢測(cè)結(jié)果顯示：36例EBVaGC組織中有28例為M型(28/36,77.8%)，M+U型為8例(8/36,22.2%)；41例EBVnGC組織中U型有33例(33/41,80.5%)，M+U型為8例(8/41,1

6、9.5%)。BGS結(jié)果顯示：36例EBVaGC平均甲基化率達(dá)86%以上；41例EBVnGC平均甲基化率為22.3%。③經(jīng)去甲基化試劑5-Aza-dc處理后，4種EBV陰性細(xì)胞系MSP電泳結(jié)果均發(fā)生變化，由原來(lái)的M型轉(zhuǎn)變成M＋U型；而4種EBV陽(yáng)性細(xì)胞系MSP電泳結(jié)果仍為U型。④EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞系RASSF1A基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平均高于陰性胃癌細(xì)胞系。5-Aza-dc作用后，EBV陰性胃癌細(xì)胞RASSF1A基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平明顯升高，EB

7、V陽(yáng)性胃癌細(xì)胞系則無(wú)明顯變化。⑤EBVaGC和EBVnGC組織中RASSF1A蛋白表達(dá)在EBVaGC和EBVnGC組織中無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：①EBV陽(yáng)性和EBV陰性胃癌細(xì)胞系中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)不同，提示EBV感染可導(dǎo)致RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)發(fā)生改變。②RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化可抑制該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；去甲基化試劑5-Aza-dc處理可使RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基