宮頸癌組織中RASSF1A基因的甲基化狀態(tài)及其臨床意義.pdf

1、背景與目的:
　　 宮頸癌是威脅全球女性健康的第二大婦科惡性腫瘤,在發(fā)展中國(guó)家其發(fā)病率位居?jì)D科腫瘤首位,且近些年來(lái)具有年輕化趨勢(shì)。據(jù)估計(jì),在全球范圍內(nèi)每年宮頸癌新發(fā)確診病例約49萬(wàn),死亡人數(shù)約27萬(wàn)。現(xiàn)已證實(shí)HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件,但是僅有HPV感染不足以使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。近些年來(lái),表遺傳學(xué)的修飾在腫瘤形成過(guò)程中的作用成為目前研究的熱點(diǎn),其主要包括DNA甲基化和組蛋白去乙?；?。由于基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是腫瘤發(fā)生的

2、早期事件,并在多種腫瘤的癌前病變中經(jīng)常出現(xiàn),因此DNA甲基化有可能成為腫瘤早期診斷的分子生物學(xué)方法。RAS相關(guān)區(qū)域家族1A(Ras associated domainfamily1A,RASSF1A)基因是一種腫瘤候選抑癌基因,其啟動(dòng)子區(qū)甲基化與多種人類(lèi)上皮性腫瘤的發(fā)生有關(guān),如肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌等。本研究通過(guò)檢測(cè)宮頸癌組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其蛋白表達(dá)情況,以分析RASSF1A基因甲基化與基因失活的相關(guān)性,并

3、探討RASSF1A基因甲基化與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系,為宮頸癌的發(fā)病機(jī)制和早期診斷提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法:
　　 1、研究對(duì)象
　　 收集2008年10月-2009年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科治療的宮頸癌患者手術(shù)切除或門(mén)診活檢的新鮮標(biāo)本60例。臨床分期(FIGO,2000):Ⅰ期25例,Ⅱ期24例,Ⅲ～Ⅳ期11例；組織學(xué)類(lèi)型:鱗癌46例,腺癌14例；組織學(xué)分級(jí):G1～G239例,G321例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

4、移者7例?；颊咧形荒挲g42歲(25～67歲)。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診,術(shù)前未接受放、化療。另選取正常宮頸組織15例作為對(duì)照。將每一份標(biāo)本均分為兩份,一份切下后立即置冰盒中,然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存；另一份用4％甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,用于免疫組織化學(xué)染色。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1甲基化特異性PCR(MSP)
　　 MSP的基本原理是基因組DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后,所有發(fā)生甲基化的胞嘧啶不產(chǎn)生脫氨基

5、反應(yīng),而未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)發(fā)生脫氨基反應(yīng)變?yōu)槟蜞奏?U)?；诖朔N堿基的改變,分別設(shè)計(jì)出甲基化和非甲基化特異性引物,再結(jié)合PCR擴(kuò)增就可以將甲基化和非甲基化基因區(qū)分開(kāi)來(lái)。
　　 2.2免疫組織化學(xué)染色
　　 采用卵白素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物法即ABC法檢測(cè)RASSF1A蛋白的表達(dá)情況,鼠抗人RASSF1A單克隆抗體的工作液濃度為1:500(美國(guó)eBioscience公司)。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

6、r>　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行處理。x2檢驗(yàn)、Fisher精確概率法、Spearman等級(jí)相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05或校正的a'=0.017。
　　 結(jié)果:
　　 1、RASSF1A基因的甲基化狀況及其與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系
　　 15例正常宮頸組織中未見(jiàn)RASSF1A基因甲基化,60例宮頸癌組織中有21例存在RASSF1A基因甲基化,甲基化陽(yáng)性率35.0％,差異具有顯著

7、性(P<0.05)。宮頸鱗癌的RASSF1A基因甲基化率明顯高于宮頸腺癌(P<0.05)；臨床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的RASSF1A基因甲基化率呈逐漸升高趨勢(shì)(16.0％→41.7％→63.6％,P<0.05),其中,Ⅲ～Ⅳ期的RASSF1A基因甲基化率明顯高于Ⅰ期(P<0.017);RASSF1A基因甲基化與宮頸癌的組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)。
　　 2、RASSF1A蛋白的表達(dá)情況及與RASSF1A基因甲基化的

8、關(guān)系
　　 正常宮頸組織中均有RASSF1A蛋白的表達(dá),而宮頸癌組織中蛋白陽(yáng)性表達(dá)率僅為48.3％,二者比較差異具有顯著性(P<0.05)。宮頸鱗癌的RASSF1A蛋白表達(dá)率顯著低于宮頸腺癌(P<0.05)；臨床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的RASSF1A蛋白表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì)(72.0％→37.5％→18.2％,P<0.05),其中,Ⅰ期和Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.017)；RASSF1A蛋白的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)

9、轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)。
　　 Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示,RASSF1A基因甲基化與RASSF1A蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.500,P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、宮頸癌組織中存在有RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)的異常高甲基化,且RASSF1A基因有純合型甲基化和雜合型甲基化兩種形式,提示RASSF1A基因甲基化與宮頸癌的發(fā)生有關(guān),且是宮頸癌的頻發(fā)事件。
　　 2、RASSF1A