雙葉酸靶向納米超聲造影劑制備及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞尋靶能力初步研究.pdf

1、第一部分納米級(jí)超聲造影劑的制備及其特性研究
　　目的制備新型納米級(jí)脂質(zhì)超聲造影劑(UCAs)，并對(duì)其基本特性及顯影效果進(jìn)行研究。
　　方法采用機(jī)械振蕩法制備脂質(zhì)UCAs，針對(duì)制備過(guò)程中3個(gè)主要影響因素，設(shè)置正交試驗(yàn)，篩選最優(yōu)制備條件，并在此條件下制備納米級(jí)UCAs，檢測(cè)其粒徑、分散度、Zeta電位、穩(wěn)定性及體外增強(qiáng)顯影效果。
　　結(jié)果正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，機(jī)械振蕩時(shí)間對(duì)粒徑影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），納米級(jí)UCAs最

2、優(yōu)制備條件為:DPPA量為0.5 mL，機(jī)械振蕩時(shí)間為90 s，離心時(shí)間為3 min;在此條件下制備出的納米級(jí)UCAs平均粒徑為（313.20±6.90）nm，分散度為0.15，Zeta電位為-12.40 mV，體外增強(qiáng)顯影效果與聲諾維相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.02，P＞0.05）。4℃冰箱保存20h后觀察，該造影劑基本特性無(wú)明顯改變。
　　結(jié)論本實(shí)驗(yàn)制備的納米級(jí)UCAs粒徑小，分散均一，性質(zhì)穩(wěn)定，具備良好的顯影能力，且易于修

3、飾，為進(jìn)一步載藥或構(gòu)建納米粒復(fù)合體等方面的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　關(guān)鍵詞:超聲造影劑;納米級(jí);脂質(zhì);顯影;納米顆粒
　　第二部分雙葉酸靶向納米級(jí)超聲造影劑對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞尋靶能力初步研究
　　目的制備一種新型的雙葉酸靶向納米級(jí)超聲造影劑((FOL)2-NBs)，探討其在體外與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的靶向結(jié)合效果，為腫瘤血管外分子成像和治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法將L-2-AD作為分枝單元在DSPE-PEG200

4、0-COOH的羧基末端構(gòu)建樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)。游離羧基DSPE-PEG2000-(COOH)2通過(guò)NHS/DCC活化并偶聯(lián)至FOL-NH2，以產(chǎn)生DSPE-PEG2000-AD-(FOL)2的綴合物，即每個(gè)DSPE-PEG2000連接兩個(gè)FOL分子，并由1 H NMR證實(shí)。將一定量的DSPE-PEG2000-AD-(FOL)2，DPPC，司盤(pán)60和吐溫80按固定比例混合，加入到1.5 mL EP管中，1.0 mL PBS定容，通入C3F8氣體置

5、換管內(nèi)空氣后密封。將混合物置于60℃的恒溫水浴鍋中加熱至完全溶解，再次用C3F8氣體置換管內(nèi)空氣。將EP管在機(jī)械振蕩器中振蕩90 s，用PBS將混合物稀釋至5 mL，300 rpm離心5 min，收集底層溶液，即為新型(FOL)2-NBs。采用上述方法制備非靶向納米級(jí)超聲造影劑及單葉酸靶向納米級(jí)超聲造影劑（FOL-NBs，即每個(gè)DSPE-PEG2000鏈連接一個(gè)FOL分子）作為對(duì)照。Delsa Nano C納米激光粒度和Zeta電位分析

6、儀檢測(cè)粒徑、分散度及Zeta電位;采用醫(yī)用彩色多普勒超聲診斷儀檢測(cè)其體外增強(qiáng)顯影效果;采用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測(cè)三組納米級(jí)超聲造影劑對(duì)FR過(guò)表達(dá)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的靶向結(jié)合能力。
　　結(jié)果1HNMR提示DSPE-PEG2000-AD-(FOL)2綴合物的成功合成，純度為90％。在普通光鏡下觀察納泡呈圓形，分布均勻且無(wú)明顯聚集。非靶向、單葉酸靶向及雙葉酸靶向組納米級(jí)超聲造影劑的平均粒徑分別為(129.43±12.33)nm

7、，(244.10±35.09) nm，(286.87±22.96) nm，且后者顯著大于前兩者（P＜0.01，P＜0.05）。體外顯影試驗(yàn)證實(shí)，三組在醫(yī)用彩色多普勒超聲診斷儀上均顯示出良好的增強(qiáng)顯影效果。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與非靶向組及單葉酸靶向組相比，雙葉酸靶向組介導(dǎo)的對(duì)MCF-7靶向結(jié)合能力顯著提高(96.76％vs0.52％，P＜0.001;96.76％vs33.33％，P＜0.001)。熒光顯微鏡下觀察，無(wú)靶向NB組中的Hoch

8、est染料標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，細(xì)胞膜周?chē)鸁o(wú)其他熒光現(xiàn)象，F(xiàn)OL-NB組中可見(jiàn)Hochest染料標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，周?chē)鷩@少量DiI染料標(biāo)記的紅色熒光，(FOL)2-NB組也可見(jiàn)呈藍(lán)色熒光的細(xì)胞核，周?chē)梢?jiàn)紅色熒光團(tuán)，并且大部分黏附在細(xì)胞膜上，相比FOL-NB組熒光強(qiáng)度強(qiáng)。結(jié)論通過(guò)增加每個(gè)DSPE-PEG2000鏈的葉酸含量，成功地制備了一種新型雙葉酸靶向納米級(jí)超聲造影劑，較之傳統(tǒng)的單葉酸靶向納米級(jí)超聲造影劑，其與FR過(guò)表達(dá)的腫