產PUFAs轉基因株的構建.pdf

1、多不飽和脂肪酸（PUFAs），尤其是長鏈多不飽和脂肪酸，具有重要的生理與保健功能。目前，ω6系列的多不飽和脂肪酸主要來源是微生物發(fā)酵，ω3系列多不飽和脂肪酸主要來源于魚油，魚油來源有限，脂肪酸提取工藝復雜且難以保證純度。
　　 Ω6系列與ω3系列多不飽和脂肪酸目前都存在價格昂貴、不能滿足市場需求的缺點。
　　 利用基因工程手段提高微生物中長鏈多不飽和脂肪酸的產量以及在油料作物中生產長鏈多不飽和脂肪酸，是兩種有效的方法。本

2、研究使用三角褐指藻的Δ6 脫飽和酶基因、Δ6 延長酶基因與Δ5 脫飽和酶基因，利用可以體外構建多拷貝表達盒的酵母表達載體pAO815，構建了含有Δ6 脫飽和酶基因、Δ6 延長酶基因與Δ5 脫飽和酶基因的多價表達載體（pAO1×D6E6D5），并構建了三個基因各有兩個拷貝的表達載體（pAO2×D6E6D5），分別轉化畢赤酵母，構建成產長鏈多不飽和脂肪酸的基因工程菌（PpDED和Pp2D2E2D）；使用來自甘藍型油菜的種子特異表達啟動子-n

3、apin 啟動子，將三角褐指藻的Δ6 脫飽和酶基因、Δ6 延長酶基因與Δ5 脫飽和酶基因構建入植物表達載體pCAMBIA1303，每個基因都處于napin 啟動子的控制下，構建好的載體轉化擬南芥和甘藍型油菜，得到了產長鏈多不飽和脂肪酸轉基因擬南芥，并初步得到轉基因的甘藍型油菜苗。具體結果如下：
　　 1.轉基因酵母的Southern 雜交結果顯示，Δ6 脫飽和酶基因、Δ6 延長酶基因與Δ5脫飽和酶基因已經整合入酵母的基因組，用p

4、AO1×D6E6D5轉化的酵母其基因組中整合有單拷貝的D6E6D5，而用pAO2×D6E6D55轉化的酵母其基因組中整合有雙拷貝的D6E6D5。
　　 2.對誘導表達的PpDED和Pp2D2E2D 進行半定量RT-PCR 分析，結果表明Δ6脫飽和酶、Δ5 脫飽和酶和Δ6 延長酶基因在Pp2D2E2D中的表達量分別是在PpDED中的1.87、1.92、1.74 倍，表明增加基因的拷貝數(shù)，可以顯著提高mRNA的表達量。
　　

5、 3. GC-MS 分析誘導表達的轉基因酵母的脂肪酸，在PpDED中，GLA、DGLA、AA 占總脂肪酸的含量分別為3.5%，1.4%，0.1%；SDA、ETA和EPA 占總脂肪酸的含量分別為0.6%，0.1%，0.05%。在Pp2D2E2D中，GLA、DGLA、AA 占總脂肪酸的含量分別為4.2%，2.4%，0.3%；SDA、ETA和EPA 占總脂肪酸的含量分別為0.6%，0.2%，0.1%。Pp2D2E2D中AA和EPA 占總脂肪酸

6、的含量分別是PpDED中的三倍和兩倍。
　　 4.分析轉入的基因在重組酵母的轉化效率，Δ6 脫飽和酶的轉化效率在PpDED中分別為22.7%（ω6）和20.7%（ω3），而在Pp2D2E2D中則增加為33.9%（ω6）和33.3%（ω3）。Δ6 延長酶的轉化效率在PpDED中分別為28.6%（ω6）和14.3%（ω3），在Pp2D2E2D中則增加為36.4%（ω6）和25%（ω3）。Δ5 脫飽和酶的轉化效率在ω3步驟中沒有變化，

7、均為33.3%，在ω6 步驟中，轉化效率則從6.7%提高到11.1%。
　　 5.得到了能夠產長鏈多不飽和脂肪酸的轉基因擬南芥，Southern 雜交結果顯示Δ6脫飽和酶、Δ5 脫飽和酶和Δ6 延長酶基因已整合入擬南芥基因組。轉入的外源基因都只在種子中表達。轉基因擬南芥種子中GLA，DGLA，AA的含量分別為6.2％、1.6％、0.5％，SDA，ETA，EPA的含量分別為0.9％、0.5％、0.05％。
　　 6.通過潮