人小涎腺上皮干-祖細胞成肝誘導的相關研究.pdf

1、目的:
　　1.體外對人小涎腺上皮干/祖細胞(hMSG-EpiPCs)進行成肝誘導，鑒定誘導獲得細胞的表型和檢測其是否具有成熟肝臟細胞相關功能。
　　2.移植hMSG-EpiPCs給急性肝損傷模型小鼠，鑒定其對小鼠急性肝功能損傷的修復能力，評估移植細胞成活率及肝內(nèi)轉(zhuǎn)歸。
　　方法:
　　1.利用組織塊貼壁法從人小涎腺組織中分離培養(yǎng)出上皮干/祖細胞，體外傳代擴增培養(yǎng)。利用免疫熒光和流式細胞術鑒定其干細胞表型和特異性

2、標記物。體外Matrigel構建三維培養(yǎng)環(huán)境下對hMSG-EpiPCs進行成肝誘導并設立空白對照組。利用免疫熒光及Real-time PCR檢測誘導而來的細胞相關肝臟細胞表型表達，并通過PAS染色、ICG攝取和CYP450功能測定檢測其相關成熟肝臟細胞功能。
　　2.使用CM-Dil熒光標記hMSG-EpiPCs并觀察標記后細胞生長情況。建立聯(lián)合免疫缺陷(SCID/Beige)小鼠20％CCl4腹腔注射急性肝損傷模型，隨機分為兩組

3、:實驗組移植hMSG-EpiPCs(n=12)，對照組注射PBS(n=12)，另取正常SCID小鼠作為空白對照組(n=3)。術后觀察小鼠體重變化。并于移植后1天、3天、1周及2周分別取材。檢測小鼠血清中人血清白蛋白含量和肝功。對取材肝臟組織進行HE染色和肝細胞表型免疫熒光鑒定，觀察炎癥反應和注射細胞存活及轉(zhuǎn)歸情況。
　　結果:
　　1.成功分離培養(yǎng)獲得人小涎腺上皮干/祖細胞。該細胞生長良好，呈鋪路石狀。免疫熒光及細胞流式分析

4、表明，獲得的hMSG-EpiPCs表達CD29、CD49f、ABCG2、PLET-1及細胞角蛋白等上皮干/祖細胞標記、涎腺上皮細胞標記CD44及CD166、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)、胸腺上皮祖細胞標記物K5和K8、內(nèi)皮細胞標記物CD31、基底膜黏蛋白(LAMININ)及Wnt信號通路標記LGR5和LGR6，部分表達胚胎干細胞標記SOX2。hMSG-Epi

5、PCs在體外三維培養(yǎng)環(huán)境下可誘導向肝細胞樣細胞分化。誘導而來細胞表達肝細胞標記蛋白ALB、CK18、CYP3A4和AAT，不表達AFP。ICG攝取和PAS染色均為陽性。CYP3A4和CYP2C19功能檢測陽性。
　　2.CM-Dil紅色熒光標記hMSG-EpiPCs生長狀況好。實驗組小鼠體重恢復速度比對照組快，肝重-體重比值更低，ALT、AST及TBIL下降速度與下降程度顯著優(yōu)于對照組。兩周后實驗組小鼠血清中可檢測到HSA。肝臟病

6、理切片顯示，實驗組小鼠一周后肝臟病變已基本恢復正常，而對照組小鼠一周后肝臟仍有病變肝細胞。肝臟組織切片顯示，兩周后實驗組有紅色熒光標記hMSG-EpiPCs存活，表達肝細胞相關標記AFP、ALB和CK18。
　　結論:
　　1.hMSG-EpiPCs可在體外成肝誘導分化為肝細胞樣細胞，表達相關表型，并具有一定的肝細胞功能。
　　2.移植hMSG-EpiPCs可促進急性肝損傷模型小鼠的肝臟功能恢復，移植細胞存活并參與病變