基于cDNA文庫方法的鼠疫耶爾森氏菌sRNAs的篩選與鑒定研究.pdf

1、背景：
　　 細菌中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的非編碼RNA,稱為“調(diào)節(jié)小RNA”(sRNA)。調(diào)節(jié)sRNA參與到病原體侵染宿主的應(yīng)激過程。鼠疫的病原菌--鼠疫耶爾森氏菌(以下簡稱鼠疫菌)是以蚤類為傳播媒介,在嚙齒動物間傳播的,感染機體后,鼠疫菌能在巨噬細胞內(nèi)存活繁殖。面對多宿主復(fù)雜的環(huán)境因素,鼠疫菌必須能夠感應(yīng)并快速適應(yīng)每個環(huán)節(jié)的環(huán)境變化,才能最終在宿主體內(nèi)存活和在自然界中傳播并最終致病,而每個適應(yīng)性反應(yīng)也必然伴隨著嚴格的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。依據(jù)

2、鼠疫菌在宿主體內(nèi)可能遇到的脅迫環(huán)境,我們采用五個不同體外模擬條件培養(yǎng)鼠疫菌,通過cDNA文庫構(gòu)建的方法來發(fā)現(xiàn)鼠疫菌在多種體外條件下表達的sRNA,試圖從整個基因組水平上獲得新的、鼠疫菌特異的sRNA,為其功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 本研究旨在鑒定鼠疫菌傳播感染過程中參與基因調(diào)控的sRNA分子,因此,我們依據(jù)鼠疫菌在傳播和感染過程中可能面臨的環(huán)境,設(shè)計并實施了多個體外模擬刺激的條件,包括溫度、生長時期、鐵缺乏(

3、模擬宿主體內(nèi)低鐵環(huán)境)、低鈣(模擬感染初期Ⅲ型分泌系統(tǒng)的形成環(huán)境)和低鎂(模擬巨噬細胞中溶酶體環(huán)境)5種刺激因素,對5種條件的鼠疫菌總RNA進行提取,等比例混合后利用膠回收和氯化鈉濃度梯度洗脫方法獲得50～400nt長度范圍的RNA,在RNA分子的5'和3'端加上特異接頭,逆轉(zhuǎn)錄后構(gòu)建cDNA文庫。對獲得的cDNA克隆進行Sanger測序,對獲得的序列進行基因定位,將基因間區(qū)或反義鏈上的序列作為候選sRNA。依據(jù)序列與基因的相對位置,對

4、候選小RNA進行分類,每一類中挑選出有代表性的若干sRNA進行Northern Bbt和RACE的實驗,驗證其真實存在性和完整性,并對文庫中得到的70nt以上的sRNA進行Real-time PCR的定量分析。最后,通過RNA二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測軟件Mfold對獲得的對sRNA進行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。
　　 結(jié)果：
　　 通過上述RNA組學(xué)的方法和每一步實驗操作嚴格的質(zhì)量監(jiān)控,我們發(fā)現(xiàn)了43個非編碼RNA,其中6個已經(jīng)注釋的RNA

5、s,其中25個為注釋基因反義鏈編碼的的sRNAs。有趣的是,其中2個與非編碼RNA完全互補。另外我們還發(fā)現(xiàn)了8個新基因間區(qū)的sRNAs。Northern blot成功的驗證了10個候選的sRNAs。29個候選sRNAs的表達分析顯示24個sRNAs在鼠疫菌進入穩(wěn)定期時高表達。
　　 結(jié)論：
　　 本研究將能獲得全長RNA序列的RACE技術(shù)結(jié)合到cDNA文庫的構(gòu)建工作中,因此我們的方法更易于獲得真實的、全長的sRNA分子。