CXCR1-2 拮抗劑iP10聯(lián)合順鉑抗小鼠乳腺癌作用的研究.pdf

1、目的：
　　趨化因子是一類小分子量蛋白，可由多種細胞產(chǎn)生，以激活和趨化免疫細胞為主要功能參與到人體內(nèi)的炎癥反應(yīng)過程以及腫瘤的進展過程中。按照N-端半胱氨酸位置及數(shù)目的不同分類為CC、CXC、CX3C、C（C代表半胱氨酸，X代表任意氨基酸）。CXCL8作為CXC類趨化因子超家族的一員，是最早被發(fā)現(xiàn)的具有趨化作用的細胞因子，能與其受體CXCR1、CXCR2特異性結(jié)合，在乳腺癌腫瘤的形成、侵襲、血管新生以及轉(zhuǎn)移中起到至關(guān)重要的作用。iP

2、10是CXCR1/2的拮抗劑，可與CXCL8競爭受體CXCR1和CXCR2,有效地干擾了CXCL8參與的炎癥、腫瘤相關(guān)的反應(yīng)過程。
　　本研究在乳腺癌小鼠模型中聯(lián)合應(yīng)用了CXCR1/2拮抗劑iP10和順鉑，研究iP10對順鉑抗腫瘤作用的增強效果以及對化療不良反應(yīng)減輕作用，為乳腺癌的治療提供新的方法。
　　方法：
　　1.體內(nèi)實驗：小鼠模型建立：將對數(shù)生長期4T1細胞配成為濃度3×105個/ml的細胞懸液，接種于雌性Ba

3、lB/C小鼠腹部兩處乳墊處。在接種腫瘤細胞后第7日可在皮下觸及腫瘤形成，隨機將小鼠分成4組：腫瘤對照組、iP10組、順鉑組和聯(lián)合用藥組，每組包含8只小鼠。順鉑組和聯(lián)合用藥組小鼠給予順鉑12.5mg/kg腹腔單次注射，其余組小鼠同時給予注射等量生理鹽水。iP10組和聯(lián)合用藥組隔日背部皮下注射500μg/kg的iP10，其他各組小鼠同時注射等量生理鹽水。標本處理：于用藥第21日，將全部小鼠處死，剝離并留取實體瘤。檢測方法：（1）比較各組小鼠

4、腫瘤體積。（2）監(jiān)測各組小鼠體重變化。（3）記錄并比較用藥后各組小鼠死亡率。（4）免疫組化法檢測EGFR炎性因子在腫瘤組織中的表達水平。（5）RT-qPCR檢測各組腫瘤組織CXCL6、CXCL8、TNF-α炎性因子的表達水平。（6）Western Blotting法檢測血管內(nèi)皮生長因子VEGF、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在腫瘤組織中的表達水平。（7）檢測腎組織MPO活力。
　　2.體外實驗：細胞培養(yǎng)：4T1腫瘤細胞體外培養(yǎng)，直至對數(shù)生長期

5、，隨機分為4組，分別給藥處理。檢測方法：（1）細胞劃痕實驗：檢測iP10聯(lián)合應(yīng)用順鉑對腫瘤細胞遷移能力的影響。（2）軟瓊脂克隆形成實驗：檢測iP10聯(lián)合應(yīng)用順鉑對腫瘤細胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.體內(nèi)實驗
　　（1）對各組留取的腫瘤體積進行比較，結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組295.90±52.57mm3（P<0.05）腫瘤平均體積小于iP10組526.14±72.54mm3（P<0.05）以及順鉑組457.65±8

6、9.96mm3（P<0.05），明顯小于腫瘤對照組747.86±106.38mm3（P<0.05）。
　　（2）比較各組小鼠體重變化情況，分析結(jié)果顯示，除順鉑組小鼠從用藥后第4日開始體重呈減輕趨勢外，其余3組體重均增長，且3組間無明顯差異，聯(lián)合用藥的毒性作用在可以耐受的范圍內(nèi)。
　?。?）對各組小鼠用藥治療后死亡率進行比較，結(jié)果顯示，除聯(lián)合用藥組未見小鼠死亡，生存率為100%，其余組均有小鼠死亡情況。順鉑組的小鼠生存率僅為7

7、0%，腫瘤對照組的小鼠生存率為90%，iP10組的小鼠生存率為90%。
　?。?）免疫組化法檢測各組小鼠腫瘤組織中表皮生長因子受體（EGFR）表達水平，結(jié)果顯示與腫瘤對照組相比較，iP10組、順鉑組以及聯(lián)合用藥組腫瘤組織的EGFR表達均受到不同程度的抑制（P<0.05），其中聯(lián)合用藥組表達水平最低（P<0.05）。
　　（5）RT-qPCR檢測各組腫瘤組織炎性因子CXCL6、CXCL8、TNF-α的mRNA表達狀況，結(jié)果顯示

8、，腫瘤對照組的CXCL6、CXCL8、TNF-α表達水平在各組中最高（P<0.05），iP10組、順鉑組和聯(lián)合用藥組三組的CXCL6（P<0.05）、CXCL8（P<0.05）、TNF-α（P<0.05）因子表達水平均明顯低于腫瘤對照組，其中聯(lián)合用藥組表達水平最低（P<0.05）。
　?。?）Western Blotting法檢測結(jié)果顯示，腫瘤對照組VEGF、NF-κB的表達水平在各組中最高（P<0.05）,其余按表達水平高低依次

9、為iP10組、順鉑組及聯(lián)合用藥組（P<0.05）。
　?。?）檢測腎組織MPO活力，結(jié)果顯示，腫瘤對照組0.53±0.09，iP10組0.28±0.08，順鉑組0.72±0.13，聯(lián)合用藥組0.43±0.06。單獨應(yīng)用順鉑治療組MPO含量在4組中最高，聯(lián)合用藥組與順鉑組比較MPO含量顯著減低（P<0.05）。
　　2.體外實驗
　?。?）細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，腫瘤對照組（0小時129.94±0.16 pixels,24

10、小時35.98±0.13 pixels,48小時0 pixels,72小時0 pixels），iP10組（0小時130.02±0.08 pixels，24小時90.00±0.11 pixels，48小時0 pixels，72小時0 pixels），順鉑組（0小時149.99±0.10 pixels，24小時93.99±0.08 pixels，48小時51.99±0.15 pixels，72小時0 pixels），聯(lián)合用藥組（0小時140

11、.00±0.11 pixels，24小時135.97±0.05 pixels，48小時130.00±0.01 pixels，72小時94.00±0.03 pixels）。
　?。?）軟瓊脂克隆形成實驗所得結(jié)果為，腫瘤對照組克隆數(shù)2±2(P<0.05)，iP10組克隆數(shù)16±3.47(P<0.05)、順鉑組克隆數(shù)8±3.22(P<0.05)和聯(lián)合用藥組克隆數(shù)7±2.32(P<0.05)形成的數(shù)目均明顯減少(P<0.05)，其中聯(lián)合用