髓樣分化蛋白-2模擬肽對巨噬細胞吞噬革蘭氏陰性細菌的抑制效應.pdf

1、目的：探討髓樣分化蛋白-2模擬肽（MDMP）對巨噬細胞吞噬革蘭氏陰性細菌的影響及所致炎癥因子分泌的抑制效應。
　　方法：利用PCR技術從PEGFP-C3質粒中擴增出表達EGFP的基因片段，通過基因重組方法構建原核表達載體 pET-32a（+）-EGFP，經(jīng)測序鑒定后，轉化至大腸桿菌 BL21（DE3）PLysS中篩選出穩(wěn)定表達的重組菌 pET-32a（+）-EGFP-BL21（ DE3） PLysS（簡稱為EGFP-BL21）。以

2、IPTG作為誘導劑誘導重組質粒表達后，通過免疫熒光技術和流式細胞術檢測RAW264.7細胞對EGFP-BL21細菌的吞噬能力以驗證EGFP-BL21的構建情況。進而以EGFP-BL21作為工具，進一步檢測RAW264.7細胞及骨髓源巨噬細胞對經(jīng)不同濃度的MDMP(1,10和100ug/ml)預處理后對EGFP-BL21的吞噬效應；并通過ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6的分泌水平。
　　結果：篩選獲得穩(wěn)定表達

3、EGFP的重組大腸桿菌 BL21（DE3） PLysS，重組菌經(jīng)巨噬細胞RAW264.7吞噬后流式和激光共聚焦檢測結果顯示細胞內出現(xiàn)明顯的綠色熒光。MDMP預處理后，流式檢測結果顯示RAW264.7細胞及骨髓源巨噬細胞對EGFP-BL21的吞噬能力受到明顯抑制，預處理組（10,100ug/ml）的吞噬系數(shù)（PI）顯著低于經(jīng)血清調理的陽性對照組（P<0.01），且細胞培養(yǎng)上清TNF-α和IL-6的分泌水平顯著降低（P<0.01）。