β2-gpⅠ對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞吞噬凋亡IL-60細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：研究β2-糖蛋白I(β2-gp I)對(duì)THP-1來源的巨噬細(xì)胞吞噬凋亡HL-60細(xì)胞的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：體外培養(yǎng)人急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60，用阿糖胞苷(Ara-C)誘導(dǎo)其凋亡并用MTT法和AnnexinV-PI聯(lián)合染色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和凋亡情況；體外培養(yǎng)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1，用佛波酯(PMA)誘導(dǎo)其分化為吞噬細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)分化后細(xì)胞表面抗原CD11b表達(dá)情況以確定分化

2、程度，墨汁吞噬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分化后細(xì)胞的吞噬能力；ELISA法檢測(cè)PS與β2-gp I的特異結(jié)合情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)β2-gp I與AnnexinV競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磷脂酰絲氨酸(PS)情況；在β2-gp I存在的條件下，觀察其對(duì)吞噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的吞噬率影響。
　　 結(jié)果：⑴Ara-C體外誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡：不同濃度Ara-C分別作用HL-60細(xì)胞24、48小時(shí)后，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)：細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核固縮變小或碎裂，染色質(zhì)濃縮或

3、邊集等。MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率結(jié)果顯示細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨著藥物濃度增加而增大，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率顯示隨著Ara-C濃度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率逐漸增大。Ara-C濃度為800ug/ml作用HL-60細(xì)胞48h后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到72.50±1.64％，早期凋亡率和晚期凋亡率分別達(dá)到19.35±0.44％，53.56±2.90％，細(xì)胞抑制率和凋亡率遠(yuǎn)大于對(duì)照組(P<0.05)。⑵PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞：150n

4、g/ml PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞72h后，細(xì)胞形態(tài)上出現(xiàn)明顯變化：細(xì)胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則伸出偽足。流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)48h后細(xì)胞表面CD11b表達(dá)水平顯示：50、100、150、200ng/ml PMA誘導(dǎo)后細(xì)胞表面CD11b陽(yáng)性率分別為17.71±0.49％、18.77±0.66％、22.93±0.53％、21.29±0.87％，實(shí)驗(yàn)組CD11b陽(yáng)性率均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。PMA誘導(dǎo)72h后，上述各濃度組CD11b陽(yáng)性

5、率分別為43.89±1.64％、49.14±0.72％、54.88±1.73％、52.11±0.81％。相同濃度PMA誘導(dǎo)72h細(xì)胞表面CD11b陽(yáng)性率均比誘導(dǎo)48h的陽(yáng)性率顯著增高(P<0.05)。吞噬能力檢測(cè)顯示用150ng/ml PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞72h后，吞噬能力達(dá)到90％以上。⑶PS與β2-gP I的特異性結(jié)合：ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組OD值>臨界值，結(jié)果陽(yáng)性，說明β2-gP I可以與PS特異性結(jié)合。⑷β2-gP I

6、與AnnexinV競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磷脂酰絲氨酸(PS)：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著β2-gP I濃度的增加，AnnexinV與早期凋亡細(xì)胞的結(jié)合率逐漸降低。加入AnnexinV避光反應(yīng)40min后，無(wú)β2-gP I時(shí)，AnnexinV(+)PI(-)率為22.72％，加入β2-gP I100ul、200ul、400 ul后AnnexinV(+)PI(-)率分別為21.43％、13.15％、8.51％，加β2-gP I前后比較差異有顯著性意義(

7、P<0.05)。β2-gP I可以與AnnexinV競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一位點(diǎn)即PS。β2-gP I與早期凋亡細(xì)胞的結(jié)合率隨著時(shí)間的增加有所降低。⑸β2-gP I對(duì)吞噬率的影響：無(wú)β2-gP I時(shí)吞噬細(xì)胞的吞噬率為10.5％，分別加入50ug/ml、100ug/ml、150 ug/mlβ2-gP I后吞噬率為16.8％、33.6％、42.7％，加入β2-gP I后與無(wú)β2-gP I時(shí)比較吞噬率增加。
　　 結(jié)論：β2-gP I可以和凋亡細(xì)