基于在片延伸的DNA測序技術(shù)研究.pdf

1、如何對基因組進(jìn)行快速有效的測序是當(dāng)今基因組科學(xué)面臨的主要挑戰(zhàn)之一。在成功完成人類基因組計(jì)劃之后，生命科學(xué)界最重要的工作之一是獲取所有個(gè)體的基因組序列，并依據(jù)獲取的結(jié)果了解不同個(gè)體基因序列間的差異，分析不同個(gè)體對疾病的易感程度的差異，以及在藥物反應(yīng)上的差異。這是未來5-10年生命科學(xué)的核心研究之一。 成熟的DNA測序技術(shù)出現(xiàn)在上70年代中期，Maxam的化學(xué)降解法和Sanger的雙脫氧鏈終止法幾乎同時(shí)出現(xiàn)在1977年。進(jìn)入20世紀(jì)

2、80年代，四色熒光標(biāo)記的測序引物法和熒光標(biāo)記雙脫氧核苷酸鏈終止法分別被商品化，標(biāo)志著自動化測序時(shí)代的到來。經(jīng)過近30年的發(fā)展，目前已有種類繁多的DNA測序技術(shù)，價(jià)格、認(rèn)讀長度、通量(速度)是判斷一種測序方法優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。利用DNA微陣列高通量的特點(diǎn)，我們設(shè)計(jì)了基于DNA微陣列在片延伸技術(shù)的DNA測序新方法(中國專利申請?zhí)枺?00610096372．4)，開展了相關(guān)的研究工作，通過特定引物與待測靶序列雜交后進(jìn)行在片延伸的方法，在延伸過程中用

3、熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸終止部分待測靶序列，通過檢測微陣列熒光信號的方法獲取序列信息，木論文的主要內(nèi)容如下： 1．測序用DNA微陣列制備的優(yōu)化： 分別制備醛基修飾玻片片基的DNA微陣列和瓊脂糖膜涂覆玻片片基的DNA微陣列，比較在兩種片基在片延伸的效率，結(jié)果表明，瓊脂糖膜涂覆玻片片基具有較高的信號點(diǎn)熒光強(qiáng)度，但同時(shí)也具有較高的熒光背景。分別設(shè)計(jì)具有不同長度手臂分子的寡核苷酸探針，比較這些探針的延伸效率，結(jié)果表明，具有較長手臂

4、分子長度的寡核苷酸探針具有較高的在片延伸效率。 2．在片延伸體系的優(yōu)化： 現(xiàn)有的在片延伸體系是針對單堿基延伸(Single Base Extension，SBE)技術(shù)開發(fā)的，我們針對基于在片延伸DNA測序技術(shù)的需要，對現(xiàn)有的反應(yīng)體系和方法進(jìn)行了優(yōu)化。比較了Tdq DNA聚合酶、Therminator DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶在延伸效率的差別，實(shí)驗(yàn)表明Therminator DNA聚合酶具有最佳的延伸效率和

5、良好的保真性。比較了三種核苷酸體系用于在片延伸的差異，結(jié)果表明逐次加入具有相同核苷兩種核苷酸(熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸和普通脫氧核苷酸)的混合物作為延伸反應(yīng)的核苷酸體系，可以滿足在片多堿基延伸測序的要求。比較了熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸和普通脫氧核苷酸的濃度比例對在片延伸信號的影響，實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)固定熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸的濃度不變，隨著普通脫氧核苷酸濃度的不斷增高，熒光信號強(qiáng)度隨之不斷下降。 3．基于在片延伸的DNA測序技術(shù)研究：

6、 在前兩項(xiàng)研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用在片延伸技術(shù)進(jìn)行DNA序列的測定。在單步多堿基測序?qū)嶒?yàn)中，運(yùn)用在片延伸的方法，準(zhǔn)確地測定了寡核苷酸探針最長4個(gè)堿基的序列信息，驗(yàn)證了基于在片延伸DNA測序技術(shù)的可行性。在多步多堿基測序?qū)嶒?yàn)中，運(yùn)用在片延伸的方法，準(zhǔn)確地測定了寡核苷酸探針最長10個(gè)堿基的序列信息。町以相信，對在片延伸技術(shù)的一些改進(jìn)可以延長該方法的認(rèn)讀長度，最終使基于在片延伸的DNA測序技術(shù)成為一項(xiàng)在價(jià)格、認(rèn)讀長度和通量上都具有優(yōu)勢的測序技術(shù)。