人工蛹蟲草的液體發(fā)酵與血清藥物化學(xué)的初步研究.pdf

1、冬蟲夏草是我國(guó)名貴的傳統(tǒng)中藥及保健品。蛹蟲草別名北冬蟲夏草，具有與冬蟲夏草相似的活性成分和藥理作用，有望成為代替冬蟲夏草的新型真菌藥源。蛹蟲草市場(chǎng)需求巨大，野生資源稀缺，因此其開發(fā)研究成為近年來的熱點(diǎn)問題。目前研究大多數(shù)集中在活性成分的提取與功能研究方面，對(duì)于蛹蟲草液體發(fā)酵過程中活性成分的形成過程研究不多，同時(shí)蛹蟲草在體內(nèi)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還不明確。本論文選取蛹蟲草菌種，對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵過程中主要活性成分的代謝變化及液體發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，并

2、在此基礎(chǔ)上，通過對(duì)蛹蟲草、蛹蟲草菌絲體及蛹蟲草液體發(fā)酵液的指紋圖譜及其給藥血清圖譜進(jìn)行相關(guān)性研究，分析蛹蟲草及其液體發(fā)酵產(chǎn)物的入血移行成分，初步探討其可能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1.研究蛹蟲草液體發(fā)酵過程中主要活性成分的代謝變化，確定各類活性成分的最佳收集時(shí)間；
　　2.對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝；
　　3.研究蛹蟲草、蛹蟲草菌絲體及蛹蟲草液體發(fā)酵液的指紋圖譜及其給藥血清圖譜的相關(guān)性

3、，初步探討其可能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.蛹蟲草液體發(fā)酵過程主要活性成分的代謝變化研究：選取蛹蟲草菌種GIM5.270，以菌絲體產(chǎn)量為指標(biāo)，對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。在此基礎(chǔ)上，延長(zhǎng)蛹蟲草液體發(fā)酵時(shí)間，根據(jù)發(fā)酵體系中不同活性成分，采取相應(yīng)的分析方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)菌絲體與發(fā)酵液中主要活性成分的含量：其中總糖采用苯酚-硫酸法；還原糖采用DNS法；蟲草酸采用比色法；蟲草素與腺苷采用HPLC。并且根據(jù)發(fā)酵體系

4、中蛹蟲草活性成分的分布情況及代謝變化，確定各類活性成分的最佳收集時(shí)間。
　　2.蛹蟲草液體發(fā)酵過程中的工藝研究：在最佳收集時(shí)間的基礎(chǔ)上，以菌絲體及胞外粗多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)分別考察營(yíng)養(yǎng)因子（包括碳源、碳源用量、氮源、復(fù)合氮源比例、氮源用量、無機(jī)鹽比例、無機(jī)鹽用量、VB1用量）及培養(yǎng)條件（溫度、搖床轉(zhuǎn)速、pH值、裝液量）對(duì)活性成分產(chǎn)量的影響，并在此基礎(chǔ)上，通過營(yíng)養(yǎng)因子正交實(shí)驗(yàn)和培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)對(duì)液體發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，篩選蛹

5、蟲草的最佳液體發(fā)酵工藝。
　　3.蛹蟲草血清藥物化學(xué)的初步研究：首先通過對(duì)洗脫梯度、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流動(dòng)相、洗脫速度、上樣體積的篩選，建立蛹蟲草藥材的HPLC指紋圖譜分析方法。隨后對(duì)10批次蛹蟲草提取液進(jìn)行HPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)，建立蛹蟲草對(duì)照指紋圖譜，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，同時(shí)建立人工培養(yǎng)的菌絲體、發(fā)酵液相應(yīng)的對(duì)照指紋圖譜，對(duì)三類產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量比對(duì)分析。在此基礎(chǔ)上，將蛹蟲草三類產(chǎn)物提取液分別進(jìn)行大鼠灌胃給藥，獲得給藥血清，使用與蛹

6、蟲草指紋圖譜相同的色譜條件，測(cè)定給藥血清的HPLC指紋圖譜，并與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，分析入血移行成分。
　　結(jié)果：
　　1.蛹蟲草液體發(fā)酵過程主要活性成分的代謝變化研究：蛹蟲草液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選結(jié)果顯示，馬鈴薯綜合PDA培養(yǎng)基的菌絲體產(chǎn)量最高。蛹蟲草液體發(fā)酵過程中菌絲體與發(fā)酵液中的主要活性成分檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著時(shí)間的進(jìn)行，菌絲體越來越多，發(fā)酵液越來越澄清；發(fā)酵體系中蟲草多糖與蟲草酸含量均呈先增高后降低的趨勢(shì)，其最佳收

7、集時(shí)間在8d左右；腺苷含量呈逐漸降低趨勢(shì)，最佳收集時(shí)間在5d左右；蟲草素含量呈逐漸增高趨勢(shì)，最佳收集時(shí)間在15d左右。
　　2.蛹蟲草液體發(fā)酵過程中的工藝研究：?jiǎn)我蛩貙?shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳營(yíng)養(yǎng)因子為：20％馬鈴薯汁1L，葡萄糖20g，蛋白胨16g，酵母粉5g，KH2PO42.5g，MgSO42g，VB116mg；最佳培養(yǎng)條件為：21℃，150r，pH6.0（自然），裝液量90mL（300mL錐形瓶），無光

8、照。在此工藝下，菌絲體與粗多糖的綜合產(chǎn)量可達(dá)到11.22g/L。
　　3.蛹蟲草血清藥物化學(xué)的初步研究：HPLC檢測(cè)確定蛹蟲草指紋圖譜分析方法為：AgeLa VenusiL ASB C18(5um,4.6×150mm)色譜柱；流動(dòng)相甲醇-水；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；流速1.0ml/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量10uL；50min梯度洗脫。采用相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)10批次蛹蟲草提取液指紋圖譜進(jìn)行處理，得到蛹蟲草對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)相似度均＞0

9、.9。同時(shí)建立了菌絲體與發(fā)酵液指紋圖譜，三類產(chǎn)物中均可觀察到腺苷峰與蟲草素峰，菌絲體中腺苷含量更高，發(fā)酵液中則蟲草素含量更高，菌絲體與蛹蟲草之間的共有峰更多。大鼠給藥血清HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜比對(duì)分析結(jié)果顯示，蛹蟲草給藥血清指紋圖譜中標(biāo)定了7個(gè)移行成分在空白血清中未出現(xiàn)，其中5個(gè)為原型成分，2個(gè)為代謝或應(yīng)激產(chǎn)物成分；菌絲體給藥血清中標(biāo)定了6個(gè)移行成分在空白血清中未出現(xiàn)，都為原型成分；發(fā)酵液給藥血清中標(biāo)定了7個(gè)移行成分在空白血清中

10、未出現(xiàn)，其中5個(gè)為原型成分，2個(gè)為代謝或應(yīng)激產(chǎn)物成分，其中在三類產(chǎn)物提取液中均有2個(gè)原型成分分別被指認(rèn)為腺苷與蟲草素。
　　結(jié)論：本論文選取蛹蟲草菌種，對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵過程中主要活性成分的代謝變化進(jìn)行了研究，分別確定了蟲草多糖、蟲草酸、腺苷和蟲草素等活性成分的最佳收集時(shí)間，在此基礎(chǔ)上，以菌絲體與胞外粗多糖產(chǎn)量為綜合指標(biāo)，通過單因素與正交實(shí)驗(yàn)確定了蛹蟲草液體發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝。同時(shí)，在構(gòu)建蛹蟲草及自培養(yǎng)的菌絲體與發(fā)酵液指紋圖譜的基礎(chǔ)